Hücrelerin ozmotik su geçirgenliği katsayısı (P f) Ölçme aquaporins düzenleyici mekanizmaları (AQPs) anlamanıza yardımcı olabilir. Burada yer küresel bitki hücresi protoplastlarının P ön tespiti protoplast izolasyon ve sürekli Banyo perfüzyonu sırasında bir ozmotik meydan okuma sonucu olan hacim değişim başlangıç hızının sayısal analizini içerir.
AQP düzenleme mekanizmaları incelenmesi hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de su ilişkileri anlamak için önemlidir. Ozmotik su geçirgenlik katsayısı, bitki protoplastlarına (P f) örneğin kurbağa oositlerine gibi küresel hücrelerin de ilke olarak uygulanabilir belirlenmesi için basit ve çok etkili bir yöntemdir burada sunulmuştur. Deneyin birinci aşaması, uygun bir izotonik çözelti ile bir bölme içine enzimatik sindirme ile ilgi konusu bitki dokusundan protoplastların izolasyondur. İkinci aşama, bir ozmotik meydan deneyi oluşur: bölmenin altındaki hareketsiz protoplastlar hipotonik bir solüsyon ile bir izotonik çözelti ile sürekli bir başlangıç perfüzyon sunulmuş ve izlenmektedir. Hücre şişmesi video kaydedildi. Üçüncü aşamada, görsel birim değişikliklere yol isimli işlenir ve hacim değişikliklerini gösteren zaman süreci osmola değişimin zaman seyri ile ilişkilidiroda perfüzyon ortamının lik P f vermek üzere, Matlab ('PfFit') yazılmış bir eğri uydurma bir prosedür kullanma.
Hücresel zarların arasında su alımı ve akış hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de bitki varlığı için temel bir gerekliliktir. Hücresel düzeyde, aquaporinler (AQPs) hücre membranı 1-3 ozmotik su geçirgenlik katsayısı (P f) düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.
Bugüne kadar, çeşitli yöntemler farklı bitki organlardan Protoplastın endojen P f ölçüm istihdam edilmiştir (yani kökleri, mezofil, endodermis, vb., Chaumont'dan ve ark. 4 tarafından incelenmiştir). P f ölçmek için yaklaşımlardan biri ozmotik bir meydan protoplastlarını maruz ve hacmi değişim başlangıç hızını izlemek için (yani., Hacim değişimi erken doğrusal faz eğimi). İki farklı yöntemleri daha önce çözümlerin bir anlık değişimi bu yaklaşıma dayanarak tarif, hem esas alınmıştır. Birincisi Hareketsizleştirme oluşmaktadırbir emme mikropipet ile protoplast ing ve çözelti akışını 5 ve bir mikropipet 6 kullanarak bir çözümden protoplast aktarılması ikinci bir anahtarlama. Hızlı çözüm döviz çok başında görüntü toplama izin bu mikropipet emme ve mikropipet aktarılması yöntemleri, büyük olasılıkla protoplastlannda fiziksel stres içeren, (hacim değişim erken doğrusal faz yakalamak için) ve özel ekipman ve uzman Mikromanipülasyondan gerektirir.
Burada tarif edildiği gibi bir yöntem içerir Mikromanipülasyondan ve banyo perfüzyon anlık değilken p f türetilmesini izin verir hücrelere bozulmasını minimuma indirmesidir.
Enzimatik sindirimden sonra bir izotonik çözelti içinde suya batırılmış olan protoplastlar, yük etkileşimi ile lamel cam bir pleksiglas tabanı (aka Lucite veya pleksiglas) bölmesi üzerinde immobilize edilir. Daha sonra, sabit bir Banyo perfüzyonu esnasında,izotonik çözelti, protoplastlar için hypoosmotic talebin oluşturulması hipotonik bir solüsyon ile uzağa akıtılmaktadır. Protoplastın şişme video çekilir ve daha sonra, banyo perfüzyon bir zaman süreci ve hücre şişmesi zamanla ilgili enformasyonun birleştirilmesiyle, P f görüntü işleme ve eğri uydurma prosedürleriyle belirlenebilir olmasıdır.
Bu yöntemin avantajı, deney çok etkili olduğunu olan tek bir analizinde aynı anda birkaç hücre kontrol etmek mümkündür, ve özel ekipman veya belirli bir mikro manipülasyon beceri gerektirmez dikkat edilmelidir. Bu yöntem için çeşitli uygulamalar mümkündür. Örneğin, mezofil gibi farklı dokular ve bitkiler, bir hücre çeşitli doğal p f belirlenmesi ve Arabidopsis yaprağı 7, mısır yaprak mezofil veya kök korteks hücreler 8-10 ya da süspansiyonunda kültürlenmiş hücrelerden 11,12 ikinci kılıf hücreleri ile birlikte gelmektedir. Additi içinde, bir oosit bu hücreler 11 olarak küresel hayvan hücrelerinin P f belirlemek mümkündür. P f katkıları ve belirlenmesi; başka bir örnek protoplastlarında (örneğin Kinazlann genler veya herhangi diğer genlerin onları etkileyebilir) kendi geninin geçici ifade ile AQP faaliyet incelenmesini içermektedir; 2 PEG dönüşüm ve kararlılıkla SlTIP2 tarafından Arabidopsis'teki mezofıl protoplastlarında,, örneğin, domates AQP SlTIP2 ifadesi için 13 f P 2-ilişkili. Son olarak, (gibi ilaçlar, hormonlar,) farklı molekül / maddelerin P f üzerindeki etkisinin incelenmesi de AQP engelleyici HgCl 2 7 örneğin, incelenebilir çözeltilerine ilave edildi.
Aşağıdaki protokol, Arabidopsis mezofil hücreleri ve bunların p f belirlenmesi protoplastların izole edilmesini tarif etmektedir.
Burada tarif edilen başka bir küresel hücrelerin de, ilke olarak uygulanabilir izole bitki protoplast P, K, örn., Kurbağa oositlerine 11 ölçmek için basit ve çok etkili bir yöntemdir. Bu metot, hücredeki bir ozmotik teste karşı tepki olarak P f ölçülmesi esasına dayanır. Bu yaklaşıma göre, diğer yöntemlerin aksine, bununla birlikte, ozmolarite çözeltilerinin değişimi, yani, bazal hücre hacmi olan izotonik çözeltisi ile başlayarak sürekli …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Araştırma (FNRS) c Scienti fi için Belçika Milli Fonundan hibe, İsrail Bilim Vakfı Kudüs FC Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı-Belçikalı Bilim Politikası ve "Recherches Concertées de Communauté française de Belgique-Eylemleri", (tarafından desteklenen MM (Grant # 1311-1312) ISF) ve NM (Grant # 1312-1312) için.
KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |