Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub> F</sub>) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo
Summary
Medir o coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) de células pode ajudar a compreender os mecanismos de regulação de aquaporinas (AQPs). P f determinação em protoplastos de células de plantas esféricas aqui apresentados protoplastos envolve o isolamento e análise numérica da sua velocidade inicial da alteração de volume, como um resultado de um desafio osmótica constante durante a perfusão de banho.
Abstract
Estudar mecanismos de regulação AQP é crucial para a compreensão das relações de água, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Apresentada aqui é um método simples e muito eficiente para a determinação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) em protoplastos de plantas, em princípio aplicável também a outras células, tais como esféricas oócitos de rã. A primeira etapa do ensaio é o isolamento de protoplastos a partir do tecido de planta de interesse por digestão enzimática para uma câmara com uma solução isotónica adequada. A segunda etapa consiste em um ensaio de desafio osmótica: protoplastos imobilizados no fundo da câmara é submetido a uma perfusão constante de partida com uma solução isotónica e seguido de uma solução hipotónica. O inchaço da célula é de vídeo gravado. Na terceira etapa, as imagens são processadas desligada para proporcionar mudanças de volume, e o curso de tempo das alterações de volume está correlacionada com a evolução no tempo da mudança de osmolarança do meio de perfusão da câmara, usando um procedimento de ajuste de curva escrito em Matlab (a 'PfFit'), para se obter P f.
Introduction
A absorção de água eo fluxo através das membranas celulares é um requisito fundamental para a existência de plantas, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Ao nível celular, aquaporinas (AQPs) desempenham um papel fundamental na regulação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) da membrana celular 1-3.
Até à data, vários métodos têm sido utilizados para medir a endógena P f de protoplastos de diferentes órgãos da planta (ou seja, raízes, mesofilo, endoderme, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uma das abordagens para medir P f é expor os protoplastos a um desafio osmótica e para controlar a velocidade inicial da sua alteração de volume (isto é., O declive da fase linear inicial da alteração de volume). Dois métodos diferentes foram previamente descritos com base nesta abordagem, tanto com base em uma troca instantânea de soluções. O primeiro consiste em immobilizing o protoplasto com uma micropipeta de sucção e interrupção do fluxo de solução a 5 e a segunda transferência de protoplasto de uma solução para outro, utilizando uma micropipeta 6. Estes métodos transferência de sucção micropipeta e micropipeta, que permitem a aquisição de imagens logo no início da troca rápida solução (para capturar a fase linear precoce de alteração de volume), provavelmente envolverá um esforço físico para protoplastos e requerem equipamentos especializados e micromanipulação especialista.
O método aqui descrito minimiza a perturbação das células, e não envolve a micromanipulação permite derivação de P f quando o banho de perfusão não é instantânea.
Após a digestão enzimática, os protoplastos, submersas numa solução isotónica, são imobilizados no fundo lamela de vidro de Plexiglass (aka Lucite ou perspex) por câmara de interacção de cargas. Em seguida, durante um banho de perfusão constante,a solução isotônica é nivelado afastado por uma solução hipotônica gerando um desafio hipoosmótico aos protoplastos. O inchamento do protoplasto é vídeo gravado e, em seguida, através da combinação da informação sobre a evolução no tempo do banho de perfusão e o curso de tempo da expansão celular, a P f é determinada por procedimentos de processamento de imagem e de ajuste de curva.
As vantagens deste método é que a experiência é muito eficiente, ou seja, é possível acompanhar algumas células simultaneamente em um único ensaio, e que não requer equipamento especial ou habilidades específicas de micromanipulação. Várias aplicações para este método são possíveis. Por exemplo, a determinação da P f nativo de uma variedade de células de diferentes tecidos e plantas, tais como mesófilo e agrupar as células da bainha de folhas de Arabidopsis 7, milho mesofilo ou células do córtex da raiz de 8-10 ou de suspensão de células cultivadas 11,12. Em additina, é possível determinar P f de células de animais, tais como células esféricas 11 oócitos. Outro exemplo envolve a análise da actividade AQP pela expressão transitória de seu gene nos protoplastos (ou quaisquer outros genes que possam afetá-los, por exemplo, genes de quinases) e determinação de sua contribuição para a P f; por exemplo, a expressão de tomate AQP SlTIP2; 2 em Arabidopsis mesofilo protoplastos por transformação PEG e determinação do SlTIP2; 2 relacionada com a P f 13. Finalmente, o exame do efeito sobre o f P de diferentes substâncias (moléculas / medicamentos, hormonas, etc) adicionado às soluções podem também ser examinadas, por exemplo, o bloqueador de AQP HgCl 2 7.
O protocolo seguinte descreve o isolamento de protoplastos de células e determinação da sua P f Arabidopsis mesófilo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrito é um procedimento simples e muito eficiente para medir a P f isoladas de protoplastos de plantas, em princípio, aplicável também a outras células esféricas, por exemplo., Os oócitos de rã 11. Este método baseia-se na medição da P f em resposta a um desafio osmótico para a célula. Em contraste com os outros métodos com base nesta abordagem, no entanto, a alteração das soluções, ou seja, da osmolaridade, não é instantânea, mas gradual, d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações do Fundo Nacional Belga para fi Scienti c Research (FNRS), o Interuniversitário atração poloneses Programa-belga política científica e os "Communauté Française de Belgique-ações de Recherches Concertées" a FC, a partir do Israel Science Foundation Jerusalém ( ISF) para MM (Grant # 1311-1312) e NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
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