Snabb och noggrann utandningsluft Ammoniak Mätning

Introduction

Ammoniak är ett allestädes närvarande biprodukt av proteinmetabolism ^1. Ammoniak mätning kan därför hjälpa läkare att bedöma olika sjukdomar och wellness stater ^2. Dock är ammoniak svåra att mäta exakt, via blod eller andedräkt, eftersom det är mycket reaktiva. Även vanligt förekommande, blodanalyser har många nackdelar, bland annat grundläggande oro noggrannhet ^3. Men det stora problemet med blodanalyser är verkligheten den att de alltid bara samlas episodiskt. Detta är viktigt eftersom ammoniak fysiologi, ungefär som blodsocker och många andra metaboliska processer, är flytande och ständigt föränderliga ^4. Däremot utandnings analyser är helt icke-invasiv och snabb, därigenom enkelt möjliggöra upprepade mätningar. Således är andetag ammoniakmätning attraktivt eftersom det kan ta upp en allvarlig icke tillgodosett behov på ett unikt sätt.

Breath samling dock presenterar unika bekymmer. Skäl flebotomi bär inneboende den JeoPardy för fel på flera oförutsägbara sätt (t.ex. tryckförband tid, svett kontamination, blodkroppar hemolys, försening i laboratoriemätning, etc. ⁵⁾ måste forskare andetag mätnings brottas med en annan grupp av nya utmaningar: variabilitet i andning, förorening med munslemhinnan eller bakterie ammoniak, inverkan av luft och apparater luftfuktighet och temperatur, etc ^6. I själva verket är det oklokt att underskatta uppgiften i anslutning experimentell utrustning för människor med hjälp av experimentella förfaranden för att upptäcka okända biologi. Delvis på grund av dessa hinder har andas ammoniak ännu inte träffat sin potential.

Häri presenterar vi våra andetag ammoniak mätprotokoll för snabba och korrekta resultat. Vår protokoll har styrka inom tre områden: monitorn, gränssnittet provtagaren, och uppmärksamhet på mänsklig påverkan. Monitorn byggdes av kollegor vid Rice University som tidigare beskrivits ^7. Grunden för MEAsurement är en kvarts förbättrad fotoakustisk spektroskopi (QEPAS) teknik som använder en piezoelektrisk kvarts stämgaffel som en akustisk transduktor. Fotoakustiska effekten uppstår när ljudvågor produceras av absorptionen av modulerad laserstrålning genom mål spår gastyp. Den spårgas detekteras med hjälp av en akustisk cell som är akustiskt resonant till den module frekvens. En absorptionsvåglängd för ammoniak valdes som är fri från spektrala interferenser från störande arter i andetag. I utandningsluften mätning människa, huvuddragen i monitorn inkluderar ett brett mätområde (från ~ 50 delar per miljard, ppb till minst 5,000 ppb) och hastighet (1 sek mätning). Hastigheten på bildskärmen möjliggör tidsupplösning genom hela andningscykeln.

Monitorn är kopplad till en speciellt utformad andetag sampler. Provtagaren består av en trycksensor och kapnograf. Den visar och arkiverar realtidmätningar av mun trycket och koldioxid samt ammoniakkoncentrationer som bestäms av sensorn. Denna sampler, därför gör det möjligt för teknikern att utvärdera kvaliteten på andningen ansträngning som andningen samlas. Detta gör att vi kan överskrida rekommendationerna för analys andetag kväveoxid (Fe _NO) som föreslagits av arbetsgruppen för American Thoracic Society / European Respiratory Society (ATS / ERS) ^8. För alla andningsprovtagningsades en disponibel en-vägs in-line-ventil som används vid mynningen port andetag provtagaren.

På grund av hastigheten på bildskärmen och de kvalitetskontroller som tillhandahålls av provtagaren, kunde vi noggrant utvärdera mänsklig påverkan ^9. De flesta ämnen, till exempel, till en början hyperventilera när du uppmanas att andas. Andra viktiga influenser, t ex oralt pH och munnen sköljningar, temperaturer på provtagaren, övervaka och alla tillhörande slangar, och läget av andning, sedan studerade, och ligger till grund for de illustrativa experiment nedan.

Slutligen, och kanske ännu viktigare, det måste understrykas att flera mycket erfarna grupper mäter andetag ammoniak med hjälp av helt olika sensorer och mätning. Dessa kan ha viktiga fördelar och giltighet. En fullständig jämförelse ligger utanför ramen för detta arbete ^10,11,12.

Protocol

1. Beredning av instrument

1. Slå på den externa strömförsörjningen till ammoniak optiska sensorplattform, laserdiod controller, en specialbyggd styrelektronikenhet (CEU), andningen provtagaren, luftpump, och laptop.
2. Kontrollera att både avgas och kylfläktar av ammoniaksensorn fungerar. ANMÄRKNING: En är placerad i den bakre delen av sensorn är det andra som finns inom den sensor, som är lättillgängligt.
3. Se till den akustiska detekteringsmodulen och nålventilen temperatur är vid 38,0 ° C genom att kontrollera den digitala displayen som sitter på sidan av ammoniaken sensorlådan. Vänta cirka 35 minuter från det att sensorn ges makt att temperaturen stabiliseras.
4. Ställ inloppsslang och munstycke temperaturen till 55 ° C genom att klicka på en ikon namnet "ChangeT" hittade på skrivbordet på andningen provtagaren. Temperaturen kan därefter ändras genom att klicka på uppåt-eller nedåtpilen följt genom att klicka på "Uppdåt Temp ". Klicka på "Exit" för att återgå till skrivbordet. Låt systemet åtminstone 5 min för temperaturutjämning. Under upprätthållande av temperaturen av provtagningsutrustningen och slangar vid 55 ° C minimerar förlusten av ammoniak yta.
5. Öppna programvaran på den bärbara datorn som styr ammoniaksensorn. Programmet kan nås inom en mapp som heter _"NH3 Breath Sensor Program" på skrivbordet. Inom denna mapp måste användaren välja ikonen "huvud LabVIEW programvara". Denna mapp innehåller flera program, men användaren måste välja "Mainsequence.vi" för att komma åt önskad gränssnittet. Välj "kör" i det övre vänstra hörnet av skärmen. OBS: Detta börjar linjen låsning kalibreringssekvensen. Lasern i QEPAS monitorn fungerar på en optimal ström, som väljs under en automatisk linje låsning procedur. Denna process kommer att ta cirka 25 minuter.
6. Skapa en ny session på provtagaren så att each ämne session har en egen fil som sparas på en ansluten flash-enhet. OBS: Detta sker genom att öppna programmet "Breath Sampler" som finns på skrivbordet på provtagaren. Det finns utrymme för att identifiera sessionen på lämpligt sätt. Alla data som genereras under sessionen sparas i flash-enheten enligt denna identifierare. Datumet för experimentet används vanligtvis som en del av filnamnet. Inloppet och munstycket temperaturen måste justeras innan den andningsprovtagningsprogram.
7. Sätt i en ny engångsmunstycke i inloppsröret. Använd engångshandskar för att undvika kontamine munstycket med ammoniak från fingrarna.

2. Breath Provtagning

OBS: Den relevanta Institutional Review Board (etiknämnden) måste godkänna någon studie som involverar människor. Det finns många faktorer som drastiskt kan påverka andnings ammoniak. Dessa faktorer kan förändra andedräkt ammoniakmätningar genom direkt enffecting systemammoniaknivåer eller genom att påverka resan av andedräkt metaboliter från lungorna till instrumenteringen.

1. Se till ämnen anländer till labbet i ett fastande tillstånd, som slukat någon mat för cirka 12 timmar vid ankomst och att de har avstått från träning på morgonen före provning.
2. Se till att inget ämne har införts i munnen i minst 1 timme före datainsamling. Se till att försöks borsta tänderna är större än en timme före testning.
3. Seat föremål framför ammoniaksensorn. Instruera motivet att hålla inloppsröret, och se till att de inte vidrör munstycket för att undvika kontaminering av ammoniak.
4. Klicka på "Start" på provtagaren gränssnittet. Har motivet andas ut i munstycket så länge de kan, eller till dess att operatören anser provet vara tillräcklig. OBS: Detta är en fullständig utandning som varar i minst 10 sekunder. Mun tryck mäts i realtid som ett surrogatför flödeshastighet. En färgkodade manometer hjälper ämnet producera och upprätthålla det önskade utandningstryck av 10 cm vatten, som utgör en utandningsflödeshastighet av 50 ml / sek. Detta flöde valdes eftersom det har antagits av ATS / ERS för protokollet att avgöra Fe _NO. Denna utandningsflöde kan uppnås av barn och vuxna. Likaså tre reproducerbara utandningar bör erhållas som skiljer sig med mindre än 10%.
5. Klicka på "stopp" på provtagaren gränssnittet när andningsprovet är slutfört.

3. Utandningsprov Mätning

1. När ett utandningsprov har analyserats, laboratorieteknikern använda bildskärmen har sedan förmågan att analysera någon del av detta andetag profilen. Den del av det andetag som är av intresse är den fas III segmentet. Denna kännetecknas av en "platå" i koncentrationen av koldioxid och finns i mitten till sent stadium av breath.
2. Välj den fas III-delen av provet genom att dra de vertikala linjerna på provtagaren gränssnitt för att börja när koldioxid platåer och stannar precis innan tryckfallet av andningen. Se figur 1 för förtydligande.
3. Spara data till flashminnet genom att klicka på "Store" på sampler pekskärm.
4. När andnings data har lagrats, kan användaren välja "start" för att inleda ett nytt utandningsprov.

4. Illustrerar effekterna av mun Skölj och pH på Breath Ammoniak

1. Prov 3 andetag för att fastställa baslinjen ammoniaknivå. Säkerställ att andetag tas ut minst 5 minuter från varandra.
2. Skölj munnen grundligt med en 30 ml alikvot av vatten under 60 sek.
3. Samla ett utandningsprov inom 60 sek för sköljning (2 §). Samla utandningsprover under loppet av nästa timme för att observera förändringen i ammoniak över tid. OBS: Sampel kan tas så ofta som varje minut, men längre intervall användes typiskt.
4. Skölj munnen ordentligt med en 30 ml alikvot av basisk lösning (natriumbikarbonat i vatten) för 60 sekunder och upprepa 4.2.1.
5. Skölj munnen ordentligt med en 30 ml alikvot av sur lösning för 60 sek och upprepa 4.2.1.

5. Illustrerar effekterna för in-och transport Slangar Temperaturer på Breath Ammoniak

1. Exempel tre andetag under loppet av 15 min med inloppstemperaturen inställd på under kroppstemperatur, ca 30 ° C.
2. Öka temperaturen på in-och transportslangen till 55 ° C respektive med hjälp av en skrivbordsikon på pekskärm på andningen provtagaren. Låt systemet åtminstone 5 minuter för att nå steady-state.
3. Prov 3 andetag, 5 minuter isär i den uppvärmda inlopp.

Representative Results

Ämnen kan förväntas ge ett brett utbud av baslinjen andetag ammoniaknivåer. Friska individer kan börja dagen med en andedräkt ammoniakmätning 100-1000 ppb. Skölja munnen med vätska omedelbart ändrar mängden detekterbar andetag ammoniak. Neutrala och sura vätskor skär typiskt mängden observer ammoniak med mer än hälften. Dessa nivåer återgår sedan till baslinjen som effekterna av sköljningen avtar. Effekterna av vatten verkar försvinna inom 15 min, medan en syra kan hålla detekterbar andetag ammoniak till ett minimum för över 2 timmar. En grundläggande sköljning, såsom natriumbikarbonat, kommer att dubbla eller tredubbla mängden detekterbar andetag ammoniak innan han återvände till baslinjen under en 20 minutersperiod. Särskilt inte väteperoxid inte tycks påverka utandningsluften ammoniak mer än andra sköljningar; alltså, verkar inte det att orala bakterier bidrar väsentligt att andas ammoniakmätning.

Såsom noterats enBove, provtagaren kopplad till ammoniaksensorn ger kontinuerliga data en tekniker kan användas för att bedöma kvaliteten på ett utandningsprov. Mun tryck och koldioxid är de två egenskaper hos en utandning som används för att validera ett utandningsprov. Mun trycket tjänar som ett surrogat för flödet av luft från lungorna in i provtagaren. Teknikern ska se till att ett ämne ger tillräckligt flöde av alveolär luft, som innehåller metaboliten av intresse, i monitorn. Tekniker bör förvänta sig en normal mun tryckområde av 9-10,5 cm vatten. Utandnings bör vara ganska stabil under loppet av 10-20 sek, vilket yttrar sig i standardavvikelsen för mun tryck. En standardavvikelsen för en kvalitets andetag bör vara under 1 cm vatten.

Mätning Koldioxid är också viktigt eftersom det möjliggör närmare utvärdering av processen för utandning. Under fas I, är utandning initieras och sammansättningen av utandad gas består av predominant anatomiska dödutrymme luft (~ 21% syre, 0,03% koldioxid, 78% kväve och 0,5% vatten), dvs. den luft som inandas under inandningsfasen för den föregående andningscykel. Under fas II, passerar alveolär gas in i anatomiska dödutrymme och blandar sig med kvarvarande döda utrymmet luft med resultatet att koncentrationen av koldioxid ökar snabbt. Koncentrationen av koldioxid i utandningsluften fortsätter att stiga, om än i långsammare takt, under fas III-utandning och toppvärdet (Sluttidal koncentration) motsvarar koncentrationen av koldioxid i venöst blod. Denna gradvisa ökning i koldioxidkoncentration under fas III är på grund av att blandning av de alveolära gaser med den återstående delen av det döda utrymmet luft och är på grund av långsam tömning av alveolära säckarna. Sammansättningen av andetag vid slutet av fas III är ungefär 13% syre, 5% koldioxid, 78% kväve och 4% vatten. Koldioxidnivåerna under fas III delen av breath kan vara allt från 30 till 40 mm Hg. Fas III motsvarar var dessa CO ₂ nivåer platå (figur 1 A-D).

Figur 1. Breath prover som integrerar fas III-delen av andningsdata för olika förhållanden. 1a) En typisk andningsprov som integrerar fas III delen av utandnings data. De gröna och röda vertikala linjer anger intervallet i vilken linjen skall analyseras. De första delarna av utandnings ignoreras. 1b) Effekten en sur sköljning har på andetag ammoniak. Omvandlingen av _NH3 till _NH4 ⁺ drastiskt minskar mängden detekterbar ammoniak. Minskat flöde resultat i minskad alveolär ammoniak i den samplade andetag som ses i 1c. Den minskade flödet gör not tillåta så mycket alveolarluft som ska provtas. 1d) Ett utandningsprov som integrerar faserna I, II, och III. Införandet av fas I och II i analysen sänker ammoniak och koldioxid avsevärt. Detta är en felaktig bild av systemisk ammoniak. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De flesta patienter har möjlighet att producera en acceptabel andedräkt på deras första försök. Dock kommer vissa ämnen kräver en upprepning av andningen. Vidare, såsom tryck och koldioxid registreras dessa kan också övervägas i dataanalys.

Discussion

Fördelarna med en icke-invasiv förfarande som kan spåra spår metaboliter i realtid är uppenbara. Däremot har området andnings forskning kämpat för att uppfylla denna potential. Breath mätning är en dynamisk process utsatta för många felkällor. Vårt tillvägagångssätt har viktiga styrkor: specifikt, har känsligheten och hastigheten på Rice QEPAS baserad ammoniak bildskärm kopplad till andnings provtagaren möjligt för oss att utvärdera och identifiera andedräkt insamlings faktorer relevant för exakt mätning. Detta tillvägagångssätt är mycket pålitlig, till exempel efter några preliminära experiment, var och en av de nästan 500 individuella andedräkt datapunkter som samlats in för senare experiment var i linje med det förväntade utfallet ^9.

Fram till de olika faktorer som påverkar utandningsluften ammoniak är förstås bättre, är det viktigt att ge noggranna och enhetliga instruktioner till patienter före ankomst. För närvarande är vi i allmänhet ber ämnen tillsnabbt efter midnatt för morgon insamling, borsta tänderna mer än 1 timme före presentationen, och undviker motion, rökning, eller fylla bilar med petroleumbränslen. Även om vi har utvärderat olika livsmedel regimer kvällen före datainsamling (t.ex. fiberrik v. låg fiber), har vi inte visat att kost övertygande effekter grundläggande uppgifter på morgonen av testet. Morgonsamlingar också minimera effekterna av uppenbara dygnsvariationer, som tycks uppstå av okänd anledning ^13.

Det kan finnas andra lika giltiga eller bättre metoder för utandningsluften ammoniaksamling. Det är möjligt, till exempel att en vanlig sköljning vid en bestämd tidpunkt före andas samlingen kan leda till användbara mätning av munslemhinnan ammoniak som också kan spegla systemiska nivåer. En annan väg kan vara att överge munhålan och mäta nasal ammoniak eller båda ^10,14. Detta senare synsätt skulle undanröja behovet for gränssnittet provtagaren. Oavsett, behöver någon metod att noga överväga en rad tekniska faktorer som är relevanta för denna volatila metabolit inklusive luftfuktighet, temperatur, pH, flöde, samt orofaryngeal biologi.

Naturligtvis, antaganden och föreställningar om mätmetod har avgörande betydelse för dataanalys. Vi tror att trycket och koldioxid är viktig aspekt av kvalitetskontroll. Det är dock inte säkert, till exempel om ammoniak bör rapporteras som uppmätts, eller koldioxid justerade, med enheter som ppb eller picomol. Som mer erfarenhet och självförtroende erhålls i de olika tekniska felkällor, de komplexa överväganden etablerade i dataanalys kommer i större fokus och kommer att driva bättre förståelse av denna mycket utmanande biologi. (Figur 2: Random och icke-slumpmässig Fel mäta aktiv biologisk Variability Versus En biologisk avspeglingar eller B Onormal andning...och Oral / Nasal Faktorer eller C och D. Utrustning Performance.)

Figur 2. Diagram av patienten att andas gränssnitt till en ammoniak monitor. A) Patienten som ska testas och är också den mest oförutsägbara delen av andnings insamlingen. Patient äta, motion och rökvanor kan ha stor påverkan på datainsamling. B) Breath utandning varierar från person till person, så en metod för att standardisera andetag är viktigt. Att tillhandahålla en visuell signal för att tillhandahålla önskvärda flödet av luft från lungorna fungerar bra för att hålla utandningar likformig. C) Breath anpassningsanordningen är nära relaterat till B i detta andetag konsekvens är en viktig faktor för att jämföra individer. Andningen sampler integrerface tillåter användaren att visa olika utandningsprov parametrar i realtid. D) Ammoniak monitorer kan visa sig med olika tekniker. Kvarts förbättrad fotoakustisk spektroskopi har många inneboende fördelar som tros vara idealisk för analys av utandningsluft. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Viktiga begränsningar för den nuvarande metoden måste erkännas. Medan provtagaren är relativt billig och portabel, ammoniaken bildskärm, såsom för närvarande utformad, är varken. Som ett resultat, ämnen behöver komma till vår hängivna andetag forskningsutrymme, eftersom vi inte lätt kan flytta vår utrustning till kliniken. Denna faktor, tillsammans med kravet på att motivets andetag andas ut ett enda långt andetag, konsekvenser som kan studeras individer (dvs sjuka patienter med levercirros, en viktig målgrupp, är ofta praktiskttiskt undantagna). Vidare, eftersom vi bara har en bildskärm, är vi begränsade i antal ämnen som kan vara realistiskt studerats i ett givet protokoll. I sin tur påverkar detta prov storlek och makt.

Som nämnts ovan, har insamlingen av kväveoxid standardiseras genom gemensamma insatser från American Thoracic Society och European Respiratory Society. Det finns för närvarande ingen motsvarande överenskommelse efter andan ammoniak, även om flera grupper gör avgörande bidrag till utvecklingen av andningsammoniakmätning. Eftersom litteraturen om spår andetag metabolit mätning i allmänhet och ammoniak i synnerhet fortsätter att utvecklas ¹⁵ det kommer säkert att bli många ändringar och förbättringar framöver. Bildskärmar som är mindre och mer portabel och billigare är avgörande för lyckade kliniska multicenterstudier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rice Ammonia Monitor System	N/A	N/A	Not available for commercial purchase
Loccioni Breath Sampler	Loccioni Humancare	N/A	Single breath version
Disposable Mouth Piece	WestPrime Healthcare	G011-200	Manufacturer is AlcoQuant
Laptop	Lenovo	N/A	Old model no longer sold by manufacturer
Acid Rinse	N/A	N/A	Household acidic drink (coffee, soft drink, citrus juices, etc)
Base Rinse	N/A	N/A	Water mixed with a nonexact amount of sodium bicarbonate (Arm & Hammer Baking Soda)
Neutral Rinse	N/A	N/A	Water