Het bestuderen van DNA Looping door Single-Molecule FRET
Summary
Deze studie geeft een gedetailleerde experimentele procedure om looping dynamiek van dubbelstrengs DNA meten met behulp van single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Het protocol beschrijft ook hoe de looping kansdichtheid genaamd de J-factor halen.
Abstract
Buigen van dubbelstrengs DNA (dsDNA) is geassocieerd met vele belangrijke biologische processen zoals DNA-eiwit herkenning en DNA verpakking in nucleosomen. Thermodynamica van dsDNA buiging is bestudeerd door een methode genaamd ringvorming die gebaseerd is op DNA ligase covalent treden korte kleverige uiteinden van dsDNA. Echter, kan ligatie efficiëntie worden beïnvloed door vele factoren die niet gerelateerd zijn aan dsDNA looping zoals de DNA-structuur rond de sloot sticky ends, en ligase kan ook invloed hebben op de schijnbare looping tarief via mechanismen zoals niet-specifieke binding. Hier laten we zien hoe dsDNA looping kinetiek meten zonder ligase door het detecteren van tijdelijke DNA lusvorming door FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA-moleculen zijn opgebouwd volgens een eenvoudige PCR-gebaseerde protocol met een FRET-paar en een biotine linker. De lus kansdichtheid bekend als de J-factor wordt uit de looping snelheid en de annealing-verhouding tussen twee scheidersted sticky ends. Door het testen van twee dsDNAs met verschillende intrinsieke krommingen, tonen we dat de factor J gevoelig is voor de eigen vorm van de dsDNA.
Introduction
Inzicht in de mechanische eigenschappen van dsDNA is van fundamenteel belang in de basiswetenschappen en technische toepassingen. De structuur van dsDNA is ingewikkelder dan een rechte spiraalvormige ladder omdat roll, tilt, en draai hoeken tussen opeenvolgende baseparen kan variëren met de volgorde. Thermische fluctuaties veroorzaken dsDNA tot diverse vormen van conformationele schommelingen zoals buigen, draaien en strekken ondergaan. Overgangen zoals smelten en knikken kan ook in extreme omstandigheden.
Onder deze moties, dsDNA buigen is de meest opvallende biologische gevolgen 1. dsDNA buigen is geassocieerd met gen repressie of activatie doordat twee verre plaatsen dicht bij elkaar. Het speelt ook een belangrijke rol in DNA verpakking in de celkern of virale capside. Buigvervorming van dsDNA kan experimenteel worden gevisualiseerd door hoge-resolutie microscopie (AFM 2 en 3 TEM) en de ThermodynAmics en kinetiek kan worden bestudeerd door looping assays, die chemisch verbinden naast elkaar plaatsen van de dsDNA.
Een dergelijke bepaling is ligase-afhankelijke cyclisatie 4. In deze assay worden dsDNA moleculen met 'sticky' (cohesieve) uiteinden circulair of gedimeriseerd door DNA ligase. Door het vergelijken van de percentages cirkel en dimeervorming kan men een effectieve molaire concentratie van een uiteinde van het DNA in de nabijheid van het andere uiteinde, die bekend staat als de J factor verkrijgen. Deze J factor dimensioneel gelijk aan de waarschijnlijkheidsverdeling van het vinden van een uiteinde van het DNA op een korte afstand van het andere uiteinde, en reflecteert dus de flexibiliteit van het DNA. Het meten van de J als functie van DNA lengte onthult vele kenmerken DNA mechanica waaronder de persistentielengte 4,5.
De worm-achtige keten (WLC) model is algemeen beschouwd als de canonieke polymeer model voor dsDNA monteurs op basis van zijn succes in toelichtingining de kracht-extensie curves verkregen DNA trekken experimenten 6, en het correct voorspellen van de J factoren van dsDNAs langer dan 200 bp 7. Bij gebruikmaking van de ringvorming kwantitatieve analyse van dsDNA-moleculen zo kort als 100 bp, Cloutier en Widom gemeten J factoren die enkele orden van grootte hoger dan de WLC modelvoorspelling 8 zijn. Een jaar later, Du et al.. geproduceerd J factoren in overleg met de WLC model met behulp van de ringsluiting assay met lagere concentraties van ligase en krijgen het afwijkende resultaat uit de Widom groep hoge ligase gebruikte concentraties 9. Deze controverse is een voorbeeld van de onvermijdelijke invloed van DNA-ligase op cycliseringsreactie kinetiek bij gebruik van de conventionele test 9. Bovendien kan DNA-ligase ook invloed hebben DNA-structuur en stijfheid door specifieke binding 10,11.
Om de technische bezwaren van eiwit-afhankelijke looping assays elimineren, we onlangs aangetoond een protein-free looping assay gebaseerd op Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Bij deze werkwijze worden een lus conformaties gedetecteerd door FRET tussen de donor en acceptor bevestigd nabij de kleverige uiteinden van een DNA-molecuul. Een objectieve type totale interne reflectie fluorescentie microscoop (TIRFM) wordt gebruikt om trajecten van reversibele looping en unlooping gebeurtenissen uit het oppervlak geïmmobiliseerde enkel DNA moleculen gedurende lange tijd nemen. Deze werkwijze heeft PCR gebaseerde assemblage van DNA moleculen aan-mismatch vrij DNA moleculen, een cruciale verbetering over eenzelfde methode Vafabakhsh Ha en 13 genereren. De single-molecule aspect van dit protocol maakt meting van de uitkeringen in aanvulling op gemiddelden ensemble terwijl de FRET aspect maakt het mogelijk om DNA looping dynamiek herhaaldelijk meten van hetzelfde molecuul, zelfs in omstandigheden die ligase activiteit kan schaden.
De TIRFM opstelling is weergegeven in figuur 1. Een aangepasteOntworpen specimen stadium wordt geplaatst over een Olympus IX61 microscoop lichaam. 532 nm en 640 nm lasers worden ingebracht van de zijkant en worden gereflecteerd door kleine elliptische spiegel 14 in de hoge NA doel kritische invalshoek bereiken op het dekglaasje-water grensvlak. Wij merken op dat meer verspreid via-doelstelling TIR met behulp van dichroïsche spiegels of prisma-gebaseerde TIR instellingen kunnen ook worden gebruikt voor deze FRET toepassing. De fluorescentie beeld gevormd door de microscoop wordt opgesplitst in donor-en acceptor beelden door een dichroïsche spiegel. Ze worden vervolgens opnieuw afgebeeld op twee helften van een EMCCD. Aanvullende emissiefilters long pass gebruikt om achtergrondsignaal verminderen.
De temperatuurregeling is essentieel voor het verkrijgen van reproduceerbare kinetische gegevens. Voor de temperatuurregeling, wordt het doel gescheiden van het neusstuk van de microscoop lichaam om warmte-overdracht, en water uit een temperatuur gecontroleerde chiller / verwarming te minimaliseren wordt gecirculeerd door een messing kraag die goed pastrond het interieur metaal onder de doelstelling jas. Deze opstelling kan robuuste temperatuurregeling bij het dekglaasje oppervlak tussen 15 en 50 ° C (Figuur 2) te bereiken. In dit werk werd het monster temperatuur op 24 ° C.
Het volgende protocol toont de stap-voor-stap procedure voor DNA constructie schatting van DNA vorm, single-molecule experiment en J factor bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een eenvoudige single-molecule assay gebaseerd op FRET werd gebruikt om looping kinetiek van DNA van verschillende intrinsieke vormen bestuderen. Gebogen DNA kan worden bereid door het herhalen van een 10-meer sequentie in fase met de spiraalvormige periode van 10,5 bp en de krommingen kunnen worden geschat PAGE. Deze dsDNAs zijn ontworpen met sticky ends op voorbijgaande lus kan stabiliseren. We onttrokken de looping tarief van de exponentiële toename van het aantal lus moleculen in de tijd. De annealing snelheidscons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken James Waters, Gable Wadsworth en Bo Broadwater voor het kritisch lezen van het manuscript. We danken ook vier anonieme reviewers voor het verstrekken van nuttige opmerkingen. Wij erkennen de financiële ondersteuning van het Georgia Institute of Technology, de Burroughs Wellcome Fonds Career Award op het Wetenschappelijk Interface, en de student onderzoeksnetwerk subsidie van NSF Fysica van levende systemen.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).
