Análise do dano epitelial Produzido pela<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infecção

Resumo

A infecção humana por Entamoeba histolytica leva a amebíase, uma das principais causas de diarréia em países tropicais. A infecção é iniciada pelo agente patogénico com as células epiteliais do intestino, provocando a abertura dos contactos célula-célula e, consequentemente, a diarreia, por vezes, seguido por uma infecção do fígado. Este artigo fornece um modelo para avaliar as interações patógeno-hospedeiro iniciais para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese.

Resumo

Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase humana, uma das principais causas de diarréia e abscesso hepático em países tropicais. A infecção inicia-se por interacção do agente patogénico com células epiteliais intestinais. Essa interação leva à ruptura das estruturas intercelulares, como junções apertadas (TJ). TJ garantir a vedação da camada epitelial para separar tecido hospedeiro do lúmen intestinal. Estudos recentes fornecem evidências de que a interrupção do TJ pelo EhCPADH112 proteína parasitária é um pré-requisito para E. invasão histolytica que é acompanhada por disfunção da barreira epitelial. Assim, a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na TJ desmontagem durante E. invasão histolytica é de suma importância para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese. Este artigo apresenta um modelo simples que permite a avaliação das interações iniciais patógeno-hospedeiro eo potencial de invasão do parasita. Os parâmetros a serem analisados ​​incluem tresistência eléctrica ransepithelial, interacção de EhCPADH112 com receptores da superfície do epitélio, as alterações na expressão e localização de marcadores epiteliais juncionais e localização das moléculas do parasita no interior das células epiteliais.

Introdução

Entamoeba histolytica é um protozoário única célula responsável da amebíase humano, uma infecção intestinal causando inflamação e diarréia. E. histolytica infecta até 50 milhões de pessoas por ano, mas apenas cerca de 10% das pessoas infectadas desenvolvem os sintomas associados a amebíase ^1. A infecção ocorre após a ingestão de alimentos contaminados ou água contendo E. cistos histolytica. No intestino, os cistos produzir trofozoítos vivos que aderem a mucina do cólon e proliferam ^2. Trofozoítos geralmente formam cistos que são excretados via fezes. Em outros casos, e por razões ainda desconhecidas, trofozoít....

Protocolo

1. Estabelecimento e Manutenção de E. Culturas histolytica

1. Crescer com culturas puras (totalmente livre de todos os outros organismos contaminantes) 1 x 10 ⁵ trofozoítos de Entamoeba histolytica HML tensão: IMSS clonar um ¹⁸ em 16 x 125 mm tubos de cultura com tampas de rosca de teflon forro (ou 1 x 10 ⁶ trofozoítos em um descartável T- 25 frascos) e 15 ml (ou 50 ml em frascos T-25) de TYI-S-33 médio (caldo de TYI, suplementado com 3% de vitamina mistura diamante, de soro de bovino adulto inactivado pelo calor 10%, a 0,5 UI / ml de penicilina e 35 ug / ml de estreptomicina) ¹⁹ dentro de....

Resultados

Para uma E. sucedida cultura histolytica, duas condições importantes devem ser cumpridas: o crescimento em condições axênicas e colheita em fase logarítmica. Anteriormente, culturas de E. histolytica foram prontamente estabelecido em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos ^22. No entanto, hoje em dia é comum ter cultivo axênico deste parasita que significa uma subcultura indefinido de amebas em um ambiente livre de bactérias que metabolizam, fungos, protozo.......

Discussão

Para o estudo in vitro interações patógeno-hospedeiro durante a infecção epitelial pelo E. histolytica, é fundamental para trabalhar com culturas bem estabelecidas de ambas as células epiteliais e trofozoítos. Por exemplo, antigamente, E. culturas histolytica geralmente tinha sido estabelecida em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos ^22,23. No entanto, a co-cultura de E. culturas histolytica é contraproducente para o estudo das .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	Hospital IMSS, México	Sem número de	trofozoítos virulentos18
TYI	caldo Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3,45% BBL Biosato peptona 58 mM glicose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6,5 mM K2HPO4 16,3 mM ácido ascórbico 8,1 mM L-cisteína 0,1 citrato de amônio férrico mM, ajuste o pH 6,819
Soro bovino adulto	Microlab, Labs., Mex.	SU146	Uso a 10% e inativado a 56 > C por 30 min
Mistura de vitaminas  de diamante- Tween 80	Uso in vitro	SR-07	a 3%
Penicilina	Beira do lago,  Méx.	34564SSA IV	0,5 UI/ml
Estreptomicina	Beira do lago,  Méx.	75757SSA IV	35 µ g/ml
Pyrex 15 ml tubos de cultura com tampa de rosca com tampas fenólicas revestidas com PTFE	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacidade 15 ml e tampas fabricadas a partir de fórmula especial resistente aos efeitos da temperatura
Placas de cultura de células, 6 poços	Corning-Costar	3516	Placas estéreis, diâmetro do poço 34,8 mm e área de crescimento 9,5 cm2.  Anéis na tampa evitam contaminação cruzada
25 cm2 frasco de cultura de células	Corning-Costar	430168	Frascos de pescoço inclinado
MDCK (Madin Darby canino rim) tipo I	American Type Culture Collection	CCL34	Células epiteliais renais cultivadas entre o 60th e 90th passagem
DMEM medium	Gibco	12800-017	Meio Eagle Modificado de Dulbecco com glicose alta.
Soro de bezerro neonato	In vitro	S-02	Use a 10%.
Mistura de penicilina/estreptomicina	In vitro	A-01	Solução estoque 10.000 U/µ g/ml
de insulina	AMSA	398MJ94SSA IV	Solução de estoque 100 UI/ml
Solução de tripsina	In vitro	EN-005	Solução enzimática a 0,05% sem cálcio e magnésio
75 cm2 frasco de cultura de células	Corning-Costar	430720	Frascos de pescoço inclinado para cultura de trofozoítos em meio TYI-S-33
Transwell suportes permeáveis	Corning-Costar	3470	0,4 µ Membrana de poliéster M, inserção de 6,5 mm em placa de 24 poços, área de crescimento 0,3 cm2
24-well placa de cultura de células	Corning-Costar	3524	Poliestireno transparente, tratado para fixação celular ideal, esterilizado por radiação gama e certificado não pirogênico
O	Roche	11836 153 001	inibe um amplo espectro de serina, cisteína e metaloproteases. Concentração final 1 mM
Trans-epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Inibidor da protease de cisteína, concentração final 40 µ g/ml
de p&alfa; ZO-1	Invitrogen	402200	IgG anticorpo policlonal de coelho contra  um peptídeo sintético na região média da proteína humana ZO-1
m&alfa; EhCPADH112	Anticorpo caseiro	sem/ número	IgM anticorpo monoclonal de camundongo contra  444-601 epítopo localizado no C-terminal de EhCPADH11221,27
FITC-cabra anti-camundongo IgM	Zymed	62-6811	Fluoresceína isotiocianato (FITC) de cabra anti-camundongo secundário
TRITC- cabra anti-coelho IgG (H+L)	Zymed	816114	Marcado com isotiocianato de tetrametil-rodamina (TRITC)  IgG anti-coelho de cabra anticorpo secundário.
Eletrodo STX2	Instrumento de Precisão Mundial	102711	Consiste em um par fixo de eletrodos duplos, com 4 mm de largura e 1 mm de espessura. Cada bastão do par de eletrodos contém um pellet de prata/cloreto de prata para medir a tensão e um eletrodo de prata para a passagem de corrente. Para uso com
EVOM EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use no modo de resistência e mantenha desconectado durante as medições de TER
Câmara Neubauer	MEARIENFELD	610610	Hemocitômetro
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Sem/número	Microscopia confocal a laser com Leica microsystems CMS Gmbh/leica Software Las af Lite/BIN
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Meio de montagem para fluorescência
4',6-diamino-2-fenilindol (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM concentração final
Albumina de soro bovino (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  concentração final para solução de bloqueio

coquetel completo de inibidores de protease Mini