대사 체학 실험 결과의 신뢰성은 시료 준비의 효율성과 재현성에 따라 달라집니다. 이후 화합물의 수천까지 분석, 또는 관심의 단지 화합물의 클래스의 옵션을 사용하여 생체 액에서 대사 산물의 추출을 가능하게하는 엄격하고 심도있는 방법입니다 설명.
대사는 생물 학적 과정에 대한 통찰력을 얻기 위해 살아있는 유기체에서 샘플 프로파일 링을 가능하게하는 새로운 분야이다. 대사의 중요한 측면은 일관성이 기술은 신뢰할 수없는 결과를 생성함으로써 샘플 준비입니다. 이 기술은 단백질의 침전, 액체 – 액체 추출, 4 개의 별개의 클래스로 대사 산물을 분별 수단으로 고상 추출을 포함한다. 감도의 결과로 증가 낮은 풍부한 분자의 개선 농축을 얻을, 그리고 궁극적으로 분자의 더 많은 신분을 확인하는 결과됩니다. 이 기술은 플라즈마, 기관지 세척액, 50 μL의 낮은 볼륨이있는 뇌척수액 샘플에 적용되었습니다. 시료는 여러 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다; 예를 들어, 단백질의 침전으로 인해 펠릿 나중에 분석을 위해 저장 될 수있다. 이 단계에서 상등액을 사용하여 액체 – 액체 추출을 겪는다물과 친수성과 소수성 화합물을 분리하는 강한 유기 용제. 분별하면, 친수성 층은 나중에 분석을 위해 처리 될 수 있거나 필요하지 않으면 폐기. 소수성 분획은 추가로 지방산, 중성 지질 및 인지질로 분별하는 세 고상 추출 단계에서 용매의 시리즈로 처리된다. 이 기술자에게 화합물의 클래스 분석을 위해 선호되는 선택할 수있는 유연성을 허용한다. 또한 화학 클래스가 존재의 지식 이후보다 안정적인 대사 산물 식별에 도움이됩니다.
생물학적 반응은 세포 프로세스의 최종 제품 등의 대사 산물을 생성합니다. 대사 체학은 이러한 과정의 결과로 유기체에 존재하는 모든 화합물의 집합이다. 그것은 세포의 생리학의 사진을 제공하고, 외부 또는 내부 자극 1, 2에 유기체의 반응을 반영한다. 이러한 자극은, 환경 독성, 약물,식이 요법, 호르몬, 질병과 관련이있을 수 있습니다. 많은 대사 체 응용 프로그램이 현재 연구자들에 의해 연구되고 있으며, 바이오 마커의 발견 3, 영양 연구 4, 식품 과학 (5), 약물 테스트 6 (가) 있습니다. 에 관계없이 응용 프로그램, 데이터, 오염 및 오탐 (false positive)의 존재의 변화가 감소 또는 제거하는 것이 바람직 할 필요가있다. 바이오 마커 발견에 또는 생물학적 F를 제어하고 질환 군 간의 차이를 결정하는, 또는 피사체에 약물의 효과를 조사하는 경우LUID는 요청을 받고 질문에 따라 선택하고, 대사 산물의 종류는 7 조사를 받고. 예를 들어, 샘플 전 염증성 시토카인의 농도에서 대사 산물을 탐구하고 투여 후, 천식 환자의 폐에 흡입 약물의 즉각적인 효과를 공부하는 경우는 우선 일 것입니다. 차이가 실제 생물학적 변화보다는 부적절한 시료 전처리 기술에 기인 관찰 보장하기 위해 표준화되고 일관성있는 실험 프로토콜은 8 필수적이다. 샘플 정보를주의 깊게 같은 몇 가지 이름을 생물학적 유체, 동물, 변형, 샘플링 시간, 대상 연령, 성별, 같은 변수가 모두 고려 및 연구 9에 고려되는 것을 보장하기 위해 문서화되어야한다. 또, 오염이나 오 탐지의 가능성을 줄이기 위해, 그것은 용매 블랭크 계측기 블랭크가 열을 분석 할 것을 권장한다.
이 프로토콜의 경우, 용어 "대사LITES는 "확인 된 실제 화합물을 참조하는 데 사용됩니다. 벤더의 소프트웨어를 사용하여, 초기 피크 발견 알고리즘은 질량 스펙트럼 피크를 검출하기 위해 사용된다. 이들 피크는 질량 대 전하 (m / z)의 비율 및 체류 시간을 기준으로 정렬된다. 두번째 알고리즘은 다음 단일 화합물에 여러 기능을 결합하는 데 사용된다. 이 나트륨, 칼륨, 또는 양성 이온화 모드 암모늄 부가 물, 및 음이온 모드 클로라이드와 같은 기능을 포함한다. 소프트웨어의 추가 옵션은 이량 체 및 기타 부가 물 등의 기능이 포함되어있다. 181.0707 m / z (M + H)에서의 피크와 함께, 예를 들어 글루코스를 사용 198.0972 m / z (M + NH 4) 및 203.05261 m / z (M + NA), 동일에 대응하는 세 개의 피크가 될 제 알고리즘을 사용하여 인 화합물. 분자식을 기반으로하는 두 번째 알고리즘은, 적용 그러나 때이 세 가지 부가 한 화합물의 결과로 그룹화됩니다.
대사 산물은 SAMP 내에서 간섭을 일으킬 수 있습니다본 발명의 화합물의 복잡성으로 인해 레. 하나의 샘플 원인의 대사 산물의 수천의 존재는 특히 낮은 풍부한 대사의 억제 신호. 샘플 정리 단백질을 방해 제거하고 다수의 분수에 이후의 분리는 샘플이되어, 피크 분리를 개선 해상도를 증가시키고 신진 대사 coelution 감소의 복잡성을 줄일 수 있습니다. 따라서, 샘플 정리 및 화합물의 개선 된 분리가 필요합니다. 그것도 다양한 극성 용매의 사용과 혼자 단백질의 침전을 보여왔다,이 문제를 11, 12를 확인할 수 없습니다. 그러나, 후속 분별 단계와 같은 MTBE와 같은 강한 유기 용매를 조합하여 대사 산물 범위가 증가된다. 양 등. (12)는 결합 MTBE 용매 추출을 사용하여 3,806 대사에 각각 메탄올 또는 단독으로 메탄올 에탄올 침전 1,851 또는 2,073에서 대사 산물의 증가를보고고체 상 추출 (SPE) 단계 하였다. 감소 된 대사 산물의 중복, 향상된 피크 분리 및 증가 된 대사 산물의 풍요 로움은이 방법으로 관찰되었다.
이러한 중합체와 같은 비 대사에서 오염은 시료 채취, 용매, 또는 장비 노이즈가 발생할 수 있으며, 잠재적으로 중요한 대사 산물의 신호 억제 될 수 있습니다. 그것은 것을 권장 기술자 (들)과 준비가 지속적으로 같은 브랜드, 유형 및 샘플 수집 튜브, 피펫 팁과 샘플의 수집과 준비를하는 동안 사용되는 다른 튜브의 크기를 사용하여 샘플링하기 전에 샘플을 수집하는 사람들. 이 데이터 분석은 관측 된 변화가 실제와 다른 소스에서 배경의 차이에 기인하지 않는 것으로 가득 차있는 신뢰를 가질 수 있습니다. 치료 효과, 질병 및 제어 그룹 또는 다른 대사 분석 사이의 차이는 증가 자신감을 조사 할 수 있습니다.
메타OD 여기에서 논의 플라즈마, BALF, 또는 뇌척수액 (CSF) 액체 크로마토 그래피 – 질량 분석 (LCMS)을 기준으로 분석을위한 비 대상으로 대사 체 프로파일 링에 대한 샘플에 적용 할 수있는 결합 된 샘플 준비 방법 13-15에 초점을 맞추고 있습니다. 액체 크로마토 그래피 (LC)와 초 고성능 액체 크로마토 모두 (UPLC) 분리 기술이 절차에이어서 MS에 연결될 수있다. 대사 체 연구를 수행하는 많은 연구자들은 단백질 침전 기술 및 / 또는 액체 – 액체 추출법 (16, 17) 중 하나를 사용한다. 우리의 연구에서이 적은 대사 산물이 검출되는 결과. 여기에 설명 된 방법 (12)은 대사 체의 넓은 범위를 덮고, 대사의 많은 수의 검출 및 식별을 가능하게한다. 이 증가는 대사 산물 클래스의 사전 분리로 인한 감소 된 샘플 및 매트릭스 효과의 높은 순도에 기인한다.
초기 제자EIN 침전 단계는 샘플로부터의 단백질을 제거하고, 냉 메탄올 (메탄올)을 사용하여 수행된다. 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE) 및 물을 사용하여 액체 – 액체 추출 (LLE)이 친수성 및 소수성 화합물을 분리하는 데 사용된다. 지방산, 중성 지질, 인지질 및 -이어서 고상 추출 (SPE)가 세 개의 클래스로 소수성 화합물을 분리하는 소수성 층에서 수행된다. 친수성 분획을 물 중 5 % 아세토 니트릴 재구성하면서 소수성 분획을 100 % 메탄올에서 재구성된다. 고상 추출 (SPE) 단계는 달리 본 것 coeluting 화합물의 수를 줄임으로써 결과에 자신의 첨가 수준은 분리 단계가 수행되지 않았 제공한다.
임상 대사 체 연구의 하나의 목표는 질병이나 치료에 관련된 대사 체의 변화를 파악하는 것입니다. 따라서 샘플 준비 기술은 강력하고, 일관성 있고, 기술자의 기술자 및 실험실에서의 실험 (22)에 양도해야합니다. 결과 데이터는 샘플의 대표해야하고, 식별 된 변경 오히려 샘플 준비 오차보다 길게 설정하여 샘플을 반영 할 필요가있다. 따라서 정확한 피펫, 정확한 온도, 섞이지 않는 층을 효율적으로 디캔팅, 질소 하에서 건조하고, 유리 및 팁 같은 브랜드와 크기의 사용이 필요합니다.
단백질 침전 공정 동안, 용액의 동량 각 펠릿으로부터 경사 분리하는 것이 중요하다. 이 볼륨의 변화를 줄이고 같은 샘플 데이터의 변화를 줄일 수 있습니다. 이 단백질의 침전 단계는 대사 체 연구를위한 필요하고, 그것은에서 단백질을 제거하기 때문에 생략 할 수 없습니다종래의 작은 분자 시료는 질량 분석기에서 분석 프로파일. 그것은 병원균 큰 거대 분자를 제거하고 릴리스는 단백질 7에서 대사 산물을 결합. 시료에서 단백질 축적 부족 HPLC 컬럼의 수명을 확장 및 정확성과 결과의 품질. 5는 혈장에이 기술을 수행 할 때 형성 단백질 펠릿 묘사 인도 증가한다. 이는 작은 분자의 검출은, 이온 풍부를 강화하고, 시료 중의 단백질의 매트릭스 효과를 줄일 수있다. 이 모든 단백질이 단계에서 제거되는 것으로 가정하고 있기 때문에 또한, LC-MS 분석에서 발견 된 아미노산 대사 변경에서보다는 단백질 분해에서 발생한 것입니다.
이 두 섞이지 않는 층으로 친수성과 소수성의 대사 산물을 분리하기 때문에 액체 – 액체 추출 단계가 중요합니다. 6 그림 LLE 절차 및 담당자를 보여줍니다LLE 층의 resentation. 두 층의 부적절한 분리 대사 손실되는 또는 두 분수에서 용출되는 중 하나가 발생합니다. 이 단계를주의 깊게 응용 프로그램은 소수성 부분에 표시 친수성 화합물의 수를 줄일 수 있습니다. 는 대표적인 결과를 포함하는 분획을 판단 할 수 없기 때문에 이러한 화합물에 대한 결과는 신뢰할 수없는됩니다. 제대로 할 때, 대사 오버랩 감소된다.
특히 지질에서뿐만 아니라, 예를 들어 티올 그룹을 포함 할 수있는 작은 분자, 산화 분해를 방지하기 위해 산소에 노출이 최소로 유지되어야한다. 따라서,이 절차는 항상 지질 또는 티올 함유 화합물의 산화를 방지 / 감소시키는 질소하에 수행된다. 또한, 샘플 및 / 또는 솔루션의 전송 샘플을 신속하게 아래로 건조 질소를 일정하게 아래에 배치 한 후, 산소 노출을 줄이기 위해 (첫 번째 분 이내) 빠르다. 일단 건조, 그들은 즉시 주이다ately 위에서 설명한 이유로 100 % 메탄올에 재현 탁.
연구소는 여러 가지 방법이 포괄적 인 방법 혜택을 누릴 수 있습니다; 화합물의 하나의 클래스를 분리하고자하는 연구자는 자신의 요구에 가장 적합한 방법의 일부를 선택할 수 있습니다. 단지 대사 풀을 구하는 단백질 침전을 수행하고자하는 사람은 그렇게 할 수있다. 친수성 대사 산물과 같은 많은 의약품, 아미노산, 당류, 또는 단지 소수성 대사 물질과 같은 트리글리 세라이드, 에폭시, 지용성 비타민, 예를 들어 인지질로서, 소망이라면, 연구자 액체 – 액체 추출을 수행 할 수 있으므로, 요구된다면 단백질 침전 다음 단계로 원하지 않는 부분을 삭제. 소수성 화합물 (중성 지질, 지방산, 인지질)의 추가 하위 분류를 요구하는 수사는 분류 단계로 진행할 수있다.
스토리지 고려 maintaini에 중요하다나중에 분석을 위해 샘플의 가능성을 겨. 샘플이 잘못 저장되어있는 경우, 분해 또는 분해가 발생할 수 있습니다. 이상적으로, 샘플은 빛에 민감 종의 저하를 방지하기 위해 멀리 빛에서 스크류 캡 호박색 유리 병에 보관해야합니다. 샘플은 또한 신진 대사 저하 23-25을 방지하기 위해 -80 ° C에서 냉동 보관해야합니다. 여기에서 자세히 설명하지 않지만, 샘플은 항상 LC-MS 분석에서 자동 시료 주입기 트레이에 4 ° C에 보관됩니다. 이것은 모든 샘플을 일정한 온도 및 주위 온도의 변화가 샘플의 점도, 용해도, 또는 안정성에 영향을주지 않는 것으로 유지되는 것을 보장한다. 그것은 같은 LLE 및 SPE로이 절차의 매뉴얼 측면이,,하는 단계와 자신감과 편안함을 얻기 위해 연습을하는 것이 좋습니다.
몇 가지 제한 사항이 기술을 위해 존재한다. 소수성 및 친수성 대사의 비밀스러운 분리는 특정 화합물을 본인 의지로 보장 할 수 없습니다이라 고한다면, 때문에 그들의 화학 성분 및 충전 상태로 두 분수로 분할. 도 4, 단백질 펠렛 추출 단계 동안 부적절한 기술 샘플 및 품질 관리 모두 불량 대사 재현성이 발생할 수있는 바와 같이 또. 통계 전원이 사용할 수 없기 때문에 특히 작은 데이터 세트에서 통계에 영향을 미칩니다. 따라서이 단계가 정확하게 각 샘플에 대해 동일한마다 수행하는 것이 중요합니다. 또 다른 한계는 시간입니다. 정지 점 샘플을 고정 할 수 있고, 준비가 다음날 계속이 프로토콜을 통해이 있지만, 하루 종일이 절차를 수행 할 따로 설정해야합니다. 셋째, 생체 시료 내의 모든 화합물은 이온 억제를 위해 평가 될 수 없습니다. 이 행렬은 각각의 대사에 영향을 미치는 방법을 식별 할 수 없기 때문에, 현재의 옵션은 이론적 endogenou 몇몇 클래스를 모방 내부 기준을 평가할 수있다의 대사. 마지막으로, 절대 식별이 방법으로 단독으로 수행 할 수 없습니다. 데이터베이스 검색 및 표준에 공동으로 협력하여 MS는 절대 대사 산물 식별이 필요합니다.
대사의 중요한 부분은 화합물의 식별이다. 여기에서 상세하게 논의되지는 않았지만, 품질 관리 샘플을 LC-MS를 이용하여 분석 하였다. 여러 샘플 준비 공백 및 악기 공백함으로써보다 안정적인 대사 히트의 결과로, 오염 물질에서 잘못된 반응의 속도를 줄이기 위해 배경 빼기로 사용하기 위해 준비 하였다. 이 단계에 이어, "분자 기능"의 수는 m / z, 머무름 시간, 동위 원소 비율, 실제 화합물의 목록을 생성하는 부가 물을 기반으로 그룹화 하였다. 화합물의 목록이 크게 감소되었지만 그들이 동일한 화합물에서 체류 부가 물에 기초하지 않은 것처럼, 결과는 더 안정적이었다. 전체 방법은 포괄적이고 isolatio 수 있습니다그러한 중성 지질, 인지질, 지방산, 트리글리 세라이드, 및 스테로이드, 또한 수성 분획 친수성 클래스를 분리하는 동안, 어느 에이코 사 노이드는 당, 플라보노이드, 및 아미노산 12 확인 된 26 소수성 대사 N.
The authors have nothing to disclose.
제시 튜토리얼은 국립 유대인 건강에 질량 분석의 핵심 시설 내에서 수행하고 개발되었다. NJH MS 시설이 CCSTI UL1 TR000154에 의해 부분적으로 지원됩니다. NIH 교부금에서 자금 P20은 HL-113445와 R01 HL-095432는이 작업을 지원했다.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |