Collecte et d'extraction de l'ADN de la salive pour le séquençage de prochaine génération
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
L'obtention de l'ADN de haute qualité pour des études génétiques humaines est essentielle dans le processus de découverte de gènes de maladies. Le sang, bien que nécessitant une intervention invasive et étant également plus cher que le prélèvement de salive, est favorisée par la création de lignées de cellules immortalisées comme une source inépuisable de l'ADN, ou iPSCs pour des études fonctionnelles, et parfois de l'ADN sanguin est utilisé lorsque des lignées cellulaires ne sont pas disponibles. Toutefois, l'obtention de sang exige un préleveur qualifié et le sang a une demi-vie plus courte que la salive 1. ADN de la salive est moins cher et plus facile à obtenir, car il peut être collecté et envoyé par la poste, sans la nécessité d'un préleveur, augmentant ainsi gisements potentiels de sujets bien au-delà de la zone de chalandise des hôpitaux et des laboratoires 2. inscription de l'étude peut être améliorée lorsque les sujets ont la possibilité de donner un échantillon de salive au lieu de sang 3, 4. préoccupations au sujet de la quantité et de la qualité de l'ADN de la salive peuvent avoir limité sa nous généraliséee en dépit de nombreuses études récentes études ont montré la pertinence de la salive totale, avec une moyenne de 4,3 x 10 5 cellules par millilitre, pour des tests ADN sur les prélèvements dans la bouche des méthodes plus anciennes qui n'ont pas obtenu d'importantes quantités de salive 2, 3, 4, 5, 6. Bien que la littérature existe modeste montrant la pertinence d'ADN dérivé de la salive totale pour les applications de génotypage y compris les méthodes à base de microréseaux 8, 9, le séquençage de prochaine génération 10, aucune étude n'a examiné (NGS). L'objectif pour l'optimisation de l'ensemble de ce protocole d'extraction d'ADN de la salive était de maximiser la quantité et de la qualité pour les applications de la génétique d'une manière rentable qui est facilement mis en œuvre dans les laboratoires avec des réactifs et consommables communs.
l'extraction d'ADN à partir de la salive nécessite plusieurs interventions: 1) la collecte et le stockage, 2) la lyse des cellules, 3) un traitement à la RNase, 4) la précipitation des protéines, 5) précipitation par l'éthanol, 6) l'ADN de la réhydratation. La solution de stabilisation tampon ADN, décrit2 précédemment, sans modification des fonctions de manière adéquate. Aucune tentative pour optimiser le traitement de la RNase et les étapes de réhydratation de l'ADN a été effectué. Pour chaque étape restante, plusieurs variables qui pourraient affecter les rendements ont été identifiés. Chaque variable a été manipulée individuellement et l'amélioration du rendement et de la qualité a été évaluée statistiquement. Pour les variables qui ont été montrées pour améliorer le rendement et / ou la qualité de l'ADN, les valeurs optimales ont été inclus dans le protocole final.
Protocol
Representative Results
Discussion
La présente procédure est un protocole d'extraction de l'ADN optimisé qui a considérablement amélioré le rendement de l'ADN de poids moléculaire élevé par rapport à des procédés classiques, sans compromettre la qualité de l'ADN. L'étape critique avec le plus grand effet sur le rendement le plus, c'est l'étape 5.2, qui comprend une étape de centrifugation plus longue au cours de précipitation à l'éthanol que n'importe quel protocole publié examiné ici, sauf u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
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