Массив сравнительная геномная гибридизация (Array CGH) для обнаружения геномной количество копий Варианты
Summary
Массив ГРЭС для обнаружения геномных вариантов числа копий заменил G-полосатую анализ кариотипа. Эта статья описывает технологии и их применение в диагностической лаборатории службы.
Abstract
Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.
Introduction
Она была известна в течение многих лет, что делеции или дополнительные копии хромосомных сегментов вызывают интеллектуальной инвалидности, дисморфизм и congentical пороки развития, а в некоторых случаях вызывать генетические синдромы 1. Тем не менее, только технологии, доступные до середины 2000-х годов для генома обнаружения этих изменений было G-диапазонов хромосомный анализ, который имеет разрешение около 5-10MB, в зависимости от региона и характера дисбаланс, и которые не могут обнаружить аномальные хромосомы, где материал был заменен на области с различной хромосомы с той же схеме диапазонов. Вспомогательные цитогенетические методы, такие как флуоресценции в гибридизация и усиления зонда мультиплексной перевязки конкретных были доступны для допроса конкретного локусов, при подозрении на конкретном синдромному дисбаланса, но он не был до введения массива сравнительной геномной гибридизации (массив ГРЭС) в рутинной клинической диагностики се р в 2-5, что генома обнаружение варианты количества копий (ВКК) стало возможным в значительной степени повышенным разрешением (обычно около 120 КБ). Клиническая работа службы наряду исследований показали, что ВКК для некоторых регионов широко распространены в нормальной популяции 6-7, в то время другой ВКК, ранее обнаружить, связаны с neurodisabilities таких как аутизм и эпилепсия 8-11.
Протокол, описанный в этой статье, используются в нашей Национальной службы здравоохранения Великобритании (NHS) клинико-диагностической лаборатории; мы используем новые стратегии гибридизации, испытания партии и робототехники для минимизации затрат в этом состоянии, финансируемых службы.
До протокола, указанного ниже, высокое качество ДНК должна быть извлечена из соответствующего исходного материала, общ крови, культивируемых клеток или образцов ткани. Спектрофотометрии можно использовать для измерения концентрации (должно быть> 50 нг / мкл) и проверить 260: 280 коэффициентов абсорбции (б следуете 1,8-2,0). Гель-электрофорез может быть использован, чтобы проверить, что ДНК с высокой молекулярной массой без значительного ухудшения.
Этот протокол предназначен для более высокую пропускную способность лабораторий, которые нумерующих 96 проб в перспективе с использованием автоматической обработки робототехники жидкие. Тем не менее, он может быть адаптирован для более низких пропускной лабораторий без автоматизации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Массив ГРЭС не будет обнаруживать сбалансированные перестройки или плоидности аномалии, такие как триплоидии. Кроме того, мозаика дисбаланс низкий уровень может быть не обнаружен. Тем не менее, массив ГРЭС имеет более высокое разрешение для обнаружения CNV, чем G-ленточной хромосомного …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
References
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals – results from four years’ clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
