Real-Time Сопротивление на основе Cell Analyzer как инструмент, чтобы очертить молекулярных путей, участвующих в нейротоксичности и Нейропротекция в клеточной линии нейронов
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Многие мозговые нарушения, связанные с есть гибель нейронов, участвующих в их патофизиологии. Улучшенная в моделях пробирке изучать нейропротекторные или нейротоксическое действие препаратов и вниз по течению путей, участвующих поможет разобраться в молекулярных механизмах нейропротекции / нейротоксичности и потенциально может способствовать развитию наркотиков. Тем не менее, многие существующие анализы токсичности в пробирке иметь серьезные ограничения – наиболее оценить нейротоксичность и нейропротекцию в одной точке времени, не позволяя наблюдать во времени процесса и кинетики эффекта. Кроме того, возможность для сбора информации о последующих сигнальных путей, участвующих в нейропротекции в реальном времени будет иметь большое значение. В текущем протоколе мы опишем использование в режиме реального времени импеданса на основе анализатора клеток, чтобы определить нейропротекторные эффекты серотонина 2А (5-HT 2A) агонистов рецепторов в нейронной клеточной линии под этикеткой без и в режиме реального времени Кондитионы с помощью измерения импеданса. Кроме того, показано, что ингибиторы второго путей мессенджеров может быть использован, чтобы очертить ниже по течению молекул, участвующих в нейропротекторного эффекта. Мы также описываем полезность этого метода, чтобы определить, способствует ли действие на пролиферацию клеток к наблюдаемому нейропротекторного эффекта. Система использует специальные микроэлектронных пластин, называемых Е-листы, содержащие чередующихся золото микроэлектродов массивы на нижней поверхности лунок, выступающей в качестве датчиков клеток. Импеданс считывания изменяется по количеству прикрепленных клеток, жизнеспособность клеток, морфологии и адгезии. Безразмерный параметр называется сотовый Индекс получают из измерения электрического сопротивления и используется для представления состояния клеток. В целом, в реальном времени сопротивление основе анализатор клеток позволяет в режиме реального времени, без наклеек оценки нейропротекции и нейротоксичности, и оценки второй участия посыльного путей, способствуя болееПодробное и высокой пропускной оценка потенциальных нейропротекторами в пробирке, для выбора терапевтических кандидатов.
Introduction
Гибели нейронов играет важную роль в патофизиологии многих мозга расстройств, связанных с 1. Наличие надежной и высокой пропускной в пробирке анализов токсичности имеет решающее значение для достичь лучшего понимания тонкостей механизмов нейротоксичности и помогут при выборе нейропротекторные молекулы в качестве терапевтических кандидатов в разработке лекарственных средств 2. Тем не менее, существует множество ограничений, чтобы наиболее широко используемые в пробирке нейротоксичности assays.They оценить поражение нервной / нейропротекцию в одной временной точке, не позволяя кинетическую разрешение; часто используют этикетку или зонд, который может вмешиваться в сигнальных путей и ограничить дополнительные исследования в той же популяции клеток, и часто трудоемкий, и во многих случаях не обеспечивают механистический понимание. В настоящем исследовании мы показали полезность в режиме реального времени импеданса на основе анализатора клеток, чтобы определить, нейротоксичность и нейропротекцию в нейронной клеточной линии в режиме реального времени и под этикеткой бесплатноусловия и обеспечить понимание последующих механизмов, с помощью анализа второго путей мессенджеров, участвующих в эффекте.
Предыдущие исследования подтвердили обоснованность анализатора в режиме реального времени клеток, чтобы определить цитотоксичность, а также воздействие на пролиферацию клеток в линии клеток по сравнению со стандартными методиками 3,4,5,6. Например, хорошая корреляция наблюдалась между показаниями стандартного жизнеспособность клеток WST-1 анализа и ценностей Сотовые Индекс в нескольких временных точках под базальных условиях распространения и после двух различных токсичных парадигм в HeLa клеток 3. В A549 и MDA-MB-231 клеток пролиферации и цитотоксичности, спровоцированной с микротрубочками стабилизатора паклитаксела показали очень близкие значения, когда оценивали путем измерения индекса клеток и стандартно используется сульфородамина В (SRB) анализ 4. В нейронной клеточной линии увековечены нейронов гиппокампа НТ-22 Сотовые измерения индекса были подтверждены на их способность тO обнаружить пролиферацию клеток, цитотоксичность и глутамата цитопротекцию против широко используемого 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) 2,5-дифенилтетразоли-бромид (МТТ) 5. В том же исследовании Результаты анализа МТТ и измерения Указатель Сотовый также хорошо коррелирует измерения нейронов пролиферацию клеток-предшественников, цитотоксичность после факторов роста лишения и спасения цитотоксичности по пан-ингибитор каспазы QVD 5. Цитотоксичность индуцированных в клетках NIH 3Т3 по Vandetanib (роста эндотелия сосудов рецептора фактора и ингибитора рецептора эпидермального фактора роста) показали сходные результаты измеренных значений индекса с клеткой или поглощение нейтрального красного анализа 6.
Недавно мы использовали систему анализатора клеток в реальном времени для оценки нейропротекторное действие серотонина 2A агонист рецептора (2A 5-НТ) (±) -2,5-диметокси-4-iodoamphetamine гидрохлорид (DOI) в нейрональной клеточной линии ( SK-N-SH клетки) и скрининг для вовлечения СЕКОой посыльного пути через контроль эффективности их химического ингибирования на наблюдаемой нейропротекции 7. Интересно, что 5-HT 2A рецепторов имеет как галлюциногенные и nonhallucinogenic агонистов (как DOI и лизурид, соответственно), которые могут активировать как общие и различные вторичного мессенджера пути 8.
Преимущества представленной техники в том, что она позволяет собирать информацию о выживаемости клеток в реальном времени в ходе дней, чтобы очертить участие второго посыльного пути, чтобы оценить возможный вклад распространения эффектов нейропротекции, и выбрать оптимальное время Для дополнительных конечных точек исследований по той же клеточной популяции. Принципиальная схема рабочего процесса в текущем протоколе представлена на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол представляет утилиту анализатора в реальном времени клеток для оценки непрерывно и под этикеток без условий Нейрозащитные / нейротоксическое действие соединений в нервных клеточных линий и, чтобы получить представление о втором пути мессенджеров, участвующих в эффе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
References
- Cavallucci, V., D’Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
