Flat Mount Imaging af Mouse Hud og sin ansøgning til Analyse af hårsækken Patterning og sensoriske Axon Morfologi
Summary
Pattedyrs hud indeholder en bred vifte af strukturer – såsom hårsækkene og nerveender – der udviser karakteristiske mønstre af rumlig organisation. Analyse af huden som en flad montering drager fordel af 2-dimensional geometri dette væv til at producere fuld tykkelse billeder af hud strukturer med høj opløsning.
Abstract
Skin er en meget heterogen væv. Intradermal strukturer omfatter hårsækkene, arrector Pili muskler, epidermal specialer (såsom Merkel celle klynger), talgkirtler, nerver og nerveender, og kapillærer. Den rumlige arrangement af disse strukturer er tæt kontrolleret på en mikroskopisk skala – som det ses for eksempel i ordnede arrangement af celletyper inden for et enkelt hårsækken – og på en makroskopisk skala – som det ses af de næsten identiske orienteringer af tusindvis af hår hårsække inden for en lokal region i huden. Visualisere disse strukturer uden fysisk sektionering huden er muligt på grund af 2-dimensional geometri dette organ. I denne protokol, viser vi, at mus hud kan dissekeres, faste, permeabilized, farves, og præciseret som et intakt todimensionalt objekt, et fladskærms mount. Protokollen giver mulighed for nem visualisering af hud strukturer i deres helhed gennem hele tykkelsen af store områder af huden ved optiCal sektionering og genopbygning. Billeder af disse strukturer, kan også integreres med oplysninger om position og orientering i forhold til kroppens akser.
Introduction
Huden er en af de største organer i kroppen, med vigtige funktioner i somato-sensation, isolering / varmeregulering og immunforsvar 1.. Forståelse af det molekylære og cellulære grundlag for udvikling hud og funktion har været for langvarig interesse på grund af den grundlæggende betydning af huden som et biologisk system og dets relevans for dermatologi. Pattedyrs hud indeholder en række flercellede strukturer, herunder lagdelte lag af keratinocytter dermal bindevæv flere typer af hårsække, talgkirtler arrector pili muskler, blodkar, og mindst et dusin forskellige klasser af afferent (sensory) og efferente nerve fibre (figur 1). Forskellige regioner af kroppen er forbundet med karakteristisk forskellige typer af huden. I de fleste pattedyr, er næsten hele kroppens overflade dækket med hud, der er tæt pakket med hårsækkene. [Mennesker og nøgne muldvarp rotter er undtagelser til ther mønster.] Hair mangler palmar overflader af hænder og fødder, som også er forbundet med specialiserede epidermale mønstre (dermatoglyphs), eksokrine kirtler og sensoriske nerveender. De cellulære og molekylære begivenheder, der styrer vækst, differentiering og rumlige arrangement af celler i hårsækken er af særlig interesse, da hver follikel udstiller i miniature, mange af de centrale elementer i organogenese 2. Disse funktioner omfatter eksistensen af stamceller og en stamcelle niche, netop koreograferede celle vandringer, og montering af flercellede strukturer fra embryologisk forskellige komponenter.
Denne artikel beskriver metoder til at dissekere, fastgørelse, mærkning og billedbehandling mus huden som et intakt todimensionalt ark, der omtales som en "hel mount" eller "flat mount" præparat. Da musehud er relativt tynd, er det muligt at billede gennem den fulde tykkelse fladtrykt skin under anvendelse af konventionel konfokal mikroskopi. Den flade mount tilgang til billeddannelse pattedyrhud er teknisk fordelagtigt, fordi det omgår behovet for fysisk sektionering, hvorved strukturer skal rekonstrueres udelukkende af optiske sektionering. Eftersom næsten hele huden behandles som et enkelt objekt, flad mount fremgangsmåde letter også billeddannelse af flere områder af kroppens overflade, mens information om position og orientering i forhold bevares til kroppens akser. Endelig strukturer i huden er typisk til stede i mønstre, der gentages med regelmæssige mellemrum, således at lette samling af billeder fra flere repræsentanter for en given struktur. Disse egenskaber er velkendt for neurobiologi, der arbejder på nethinden, en todimensional del af det centrale nervesystem, som har tilsvarende fordele, til undersøgelser af neuronal morfologi 3.
Den flade mount tilgang beskrives her er af særlig utility for at studere strukturer, der udviser rumlige organisation på en relativt stor skala i det todimensionale plan af huden. Et eksempel på storstilet rumlige organisering er koordineret polaritet hårsækkene og hårsækken-associerede strukturer – Merkel celle klynger, arrector Pili muskler, talgkirtler og nerveender 4. Hårsækkene er orienteret i en vinkel i forhold til planet af huden, og komponenten af hårsækken vektor, der ligger inden for det 2-dimensional plan huden udviser generelt en orientering med hensyn til kroppens akser, der er præcist bestemt for hver position på kroppen. For eksempel hårsækkene på bagsiden point fra rostralt caudale hår på den dorsale overflade af fødderne peger fra proximale til den distale. Hårsækken orientering styres af plane celle polaritet signalering (PCP også kaldet tissue polaritet 5). Dette signalsystem blev opdaget i Drosophila, hvor en lillesæt af centrale PCP gener fandtes at styre orienteringen af kutikulære hår og børster. Tre pattedyr orthologues af centrale PCP gener – Frizzled homolog 6 (Fzd6, også kaldet FZ6) cadherin EGF LAG syv-pass type G-receptor 1 (Celsr1), og vang-lignende 2 (Vangl2) – spille analoge roller i pattedyr hud, koordinerer orienteringer af hårsækkene med kroppens akser. Undersøgelser af FZ6 knockout-mus (Fzd6 tm1Nat, i det følgende benævnt FZ6 – / -) viser, at den primære defekt i fravær af PCP signalering er en indledende randomisering eller forvaltningsmæssigt hårsækken orientering, uden effekt på den indre struktur af folliklerne 6-8. En anden ikke-PCP, optræder senere at fremme den lokale tilpasning af nærliggende hårsække, der fører til produktion af store hår mønstre som hvirvler og totter.
Et andet eksempel på stor skalarumlige organisation i huden ses i morfologi af sensoriske Axon dorne. Sensoriske neuroner, der innerverer huden har deres celle organer i den dorsale rod og trigeminusganglier. Disse neuroner detektere temperatur, smerter, kløe, og forskellige typer af mekaniske deformationer, som rammer huden og håret 9. De kan opdeles i subtyper baseret på axon diameter og ledningshastighed terminal nerveenden struktur, og mønstrene af ekspression af receptorer, kanaler og andre molekyler. På grund af den høje tæthed af innervation i huden, analyser, der involverer visualisere alle axoner (f.eks anti-neurofilament-immunfarvning) eller endog alle axoner af en enkelt klasse (som ses, når en enkelt celle er markeret af ekspression af en fluorescerende reporter) generelt afslører en tæt superposition af axoner, der gør det umuligt at definere morfologi af en enkelt dorn. For at omgå dette problem, har vi brugt meget sparsom genetisk rettet labeling at producere dorsale hud prøver, hvor de enkelte godt isoleret Axon dorne er visualiseret ved ekspression af et histokemisk reporter, human placental alkalisk phosphatase 10. Denne fremgangsmåde giver den utvetydige visualisering af individuelle axon arbor morfologier og en definition af somatosensoriske neuron typer baseret på morfologiske kriterier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beherskelse af dissektion ovenfor beskrevne metoder kræver kun tålmodighed, en rolig hånd og et par gode Dissektionsværktøj. Ryghuden dissektion er forholdsvis let, men halen og mund hud dissektioner – især ved tidlig postnatal alder – er mere udfordrende. Ved tidlig prænatal aldre (f.eks før E15), er vanskelig at fjerne uden at rive det i huden. Bekvemt, for mange studier af vækst og mønster af hud strukturer i mus, de begivenheder af interesse opstår efter fødslen, som det for eksempel ses i under…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. . Rook’s Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk, ., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
