Нанозолото Маркировка из дрожжей эндосомных системы для Ультраструктурные Анализы
Summary
Дрожжи, Saccharomyces CEREVISIAE, является одним из ключевых модельный организм для выявления и изучения генов, регулирующих биогенез и функции системы эндосомный. Здесь мы представляем подробный протокол для конкретного маркировке эндосомных отсеков для ультраструктурных исследований.
Abstract
Эндосомы являются одним из основных мембраны сортировки контрольно-пропускные пункты в эукариотических клетках и регулируют утилизацию или уничтожение белков в основном из мембраны плазмы и Гольджи. В результате система эндосомный играет центральную роль в поддержании гомеостаза клетки, и мутации в генах, принадлежащих к этой сети органелл, соединенных между собой везикулярного транспорта, вызвать серьезные патологии, включая рак и нейробиологических расстройств. Поэтому первостепенное значение для понимания механизмов, лежащих в основе биогенеза и организацию системы эндосомный. Дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE уже сыграли ключевую роль в решении этой задачи. Чтобы специально маркировать и анализировать на ультраструктурном уровне в эндосом систему этого модельного организма, мы представляем здесь подробный протокол для положительно заряженной поглощения Нанозолото по сферопластов последующим визуализации этих частиц через реакции повышения серебра. Этот метод также является ценным слишкомл для морфологического исследования мутантов с дефектами торговли эндосомный. Кроме того, он применим не только для ультраструктурных экзаменов, но он также может быть объединена с immunogold маркировок для локализации белка исследований.
Introduction
Система эндосомный является одним из основных мембрана сортировка аппарат, который играет несколько важных клеточных функций, включая торговлю лизосомальных ферментов сортировки рецепторов и утилизации мембране (PM) рецепторов 1,2. Эндосомы делятся в трех различных отсеков, то есть. ранние эндосомы (EE), поздние эндосомы (LE) и эндосомы утилизации. Эта классификация основана на время, необходимое для эндоцитарных материала для их достижения, на конкретных маркерных белков и их морфологии. Мембраны, то есть белковые и липидные бислои, интернализованные от премьер-министра может быть либо доставлен лизосом через эндосомах деградации или быть возвращен. Мембраны также транспортируется в эндосомах от Гольджи и, аналогично, либо продолжать лизосом или быть получены обратно в Гольджи. Кроме того, белки можно разделить на просвета пузырьков начинающим внутрь от эндосомный ограничения мембраны, процесс, который приводит к образованиюподкатегория LE, то мультивезикулярные органы.
Система эндосом дрожжи относительно менее сложным, чем у высоких эукариотических клетках. Дрожжи эндосомы делятся на ЭО и LE. В отличие от клеток млекопитающих они не содержат переработки эндосомы, но и тканеспецифические лизосомы, связанных с органеллы. Следовательно, они имеют менее сложную сеть маршрутов эндосомных торговли людьми 3,4. Поэтому дрожжи представлял и до сих пор представляет собой выгодное экспериментальной системы для изучения некоторых из принципов, лежащих мембраны трафика в системе эндосомный. Это преимущество подчеркивается тем фактом, что многочисленные гены, участвующие в эндосомных путей были первоначально изолированных с генетическими экранах в дрожжах 5. В то время как система эндосомный дрожжи в дикого типа и мутантных клеток была тщательно изучена с помощью биохимических и флуоресцентных подходы микроскопии, ее исследование в ультраструктурном уровне только былминимальным. Морфологические анализы особенно актуальны в дрожжах, потому что большинство эндосомных органелл определяются как знаки препинания структур с помощью флуоресцентной микроскопии, которые делают трудным их Однозначная идентификация 6. К сожалению, только ограниченное число антисыворотками признавая белковых маркеров дрожжи эндосомные работает в иммуно-электронной микроскопии (IEM) препараты 7-10. Для некоторых белков, эта проблема была преодолена путем эндогенного мечения интересующего гена и использование антитела, распознающего тег, чтобы обнаружить его 7,11,12. Часто, однако, белки не обнаруживается IEM из-за их низкого уровня экспрессии. Их экспрессия не является решением, потому что такой подход может вызвать неправильное локализации и / или изменения в органелл морфологии / функций. Таким образом, маркировка из эндоцитотических отсеков с зондом обнаруживаемых с помощью электронной микроскопии EM является эффективным методом. Это оптимальное решение, особенно если пр.ОБЕ входит в эндоцитического маршрут в зависимости от времени, что позволяет узнать, когда это будет означать определенную органеллу 6.
Поглощение положительно заряженного нанозолотом дрожжевыми сферопластов (т.е.. Дрожжевых где клеточная стенка была ферментативно удалены) успешно используется для выявления дрожжи эндосомный отделений 10. Эти частицы сильно связываются с отрицательно заряженных липидов, составляющих биологические мембраны. Таким образом, положительно заряженные Нанозолото ассоциируется с ПМ, проникает в клетку путем эндоцитоза и проходит через ЭО и LE до достижения вакуоль. Эти мелкие частицы золота, однако, не имеют подходящий размер, чтобы быть замеченными EM. Чтобы сделать их видимыми, их размер может быть увеличен за счет химических реакций, которые приводят к отложению серебра или золота вокруг золотого зонда 13-15. Мы разработали и успешно применяется подход IEM на основе метода Tokuyasu выполнять субклеточнаялокализация изучает 8,16. Этот метод позволяет выполнять immunogold маркировку на дрожжевых препаратов с отличным разрешением морфологии 8,17-24. Мы также установил процедуру, сочетающий этот протокол IEM с Нанозолото маркировки системы дрожжи эндосомный отсеков 6. Используя этот подход, мы морфологически характеризуются различные подклассы эндосомах и ультраструктурному анализу мутантов с людьми эндосомный дефект 6,25. Более того, мы показали, что это Нанозолото маркировки могут быть объединены с immunogold маркировок обеспечивая возможность изучить распределение белка имеется заинтересованность, на различных субпопуляций эндосом. Здесь мы представляем, как маркировка системы дрожжи эндосомный с положительно заряженным нанозолотом практически выполнена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Иммуно-электронно-микроскопическое является метод, который позволяет объединить локализацию белков с ультраструктурном разрешением носителей и органелл, где эти белки проживают. Это особенно важно при изучении системы дрожжи эндосом, потому что ее отсеки выглядят как знаки препинан…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Рене Scriwanek за помощь с подготовкой рисунке. FR поддерживается ECHO (700.59.003), ALW Открытая программа (821.02.017 и 822.02.014), сотрудничество DFG-НВО (DN82-303) и ZonMw VICI (016.130.606) гранты.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
