Nanoguld Märkning av jäst endosomal System för Ultra Analyser
Summary
Jäst, Saccharomyces cerevisiae, har varit en viktig modellorganism för att identifiera och studera gener som reglerar biogenes och funktioner endosomal systemet. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för den specifika märkningen av endosomala fack för ultrastrukturella studier.
Abstract
Endosomes är en av de stora membransorterings vägspärrar i eukaryota celler och de reglerar återvinning eller destruktion av proteiner främst från plasmamembranet och Golgi. Som ett resultat av endosomal systemet spelar en central roll för att upprätthålla cell homeostas, och mutationer i gener som hör till detta nätverk av organeller sammankopplade med vesikulär transport, orsaka allvarliga sjukdomar, inklusive cancer och neurobiologiska störningar. Det är därför av största betydelse för att förstå den bakomliggande mekanismen biogenes och organisation av det endosomala systemet. Den jästen Saccharomyces cerevisiae har varit avgörande i denna uppgift. För att specifikt märka och analysera på ultra nivå endosomal systemet av denna modell organism, presenterar vi här ett detaljerat protokoll för den positivt laddade nanoguld upptag av sfäroplaster följt av visualisering av dessa partiklar genom en silverförbättring reaktion. Denna metod är också en värdefull förl för morfologisk undersökning av mutanter med defekter i endosomal trafficking. Dessutom är det inte bara gäller för ultrastrukturella undersökningar, men det kan också kombineras med immunogold labelings för proteinlokaliseringsutredningar.
Introduction
Det endosomal systemet är ett stort membran sorteringsapparat som spelar flera viktiga cellulära funktioner, inklusive handel med lysosomala enzymsorterings receptorer och återvinning av plasmamembran (PM) receptorer 1,2. Endosomes är uppdelade i tre olika fack, dvs. de tidiga endosomes (EE), den sena endosomes (LE) och återvinnings endosomer. Denna klassificering är baserad på den tid det tar för endocyteras material för att nå dem, på specifika markörproteiner och deras morfologi. Membran, dvs protein och lipidbiskikt, internaliserade från PM kan antingen levereras till lysosomer via endosomes för nedbrytning eller återvinnas tillbaka. Membran transporteras också till endosomes från Golgi och på samma sätt, antingen fortsätta att lysosomer eller hämtas tillbaka till Golgi. Dessutom kan proteiner sorteras i luminala vesiklar spirande inåt från det endosomala begränsande membranet, en process som leder till bildning aven underkategori av LE, de multivesikulära kroppar.
Jästen endosomala systemet är förhållandevis mindre komplext än ett av höga eukaryota celler. Jäst endosomer är indelade i EE och LE. I motsats till däggdjursceller de inte innehåller återvinnings endosomer utan även vävnadsspecifika lysosom relaterade organeller. Därför har de en mindre komplext nätverk av endosomala smugglingsvägar 3,4. Jäst har därför representerat och fortfarande utgör ett fördelaktigt experimentellt system för att studera några av de principer som underliggande membrantrafik i endosomal systemet. Denna fördel understryks av det faktum att ett stort antal gener som är involverade i det endosomala vägar har ursprungligen isolerats med genetiska skärmar i jäst 5. Även jästen endosomal systemet i vildtyp och muterade celler har studerats med hjälp av biokemiska och fluorescens mikroskopi metoder har sin undersökning på den ultrastrukturella nivån bara varitminimal. Morfologiska analyser är särskilt relevanta i jäst eftersom de flesta av de endosomala organ detekteras som punktera strukturer genom fluorescensmikroskopi, vilket gör svårt att entydigt identifiera 6. Tyvärr endast ett begränsat antal antiserum erkänna jäst endosomala proteinmarkörer arbetar i immuno-elektronmikroskop (IEM) förberedelser 7-10. För vissa proteiner, har detta problem kringgås genom den endogena taggning av genen av intresse och användning av en antikropp som känner igen taggen för att detektera det 7,11,12. Ofta är dock proteiner påvisas med IEM grund av deras låga nivåer. Deras överuttryck är inte en lösning eftersom denna metod kan framkalla mis-lokaliseringar och / eller förändringar i organell morfologi / funktioner. Således märkning av de endocytiska fack med en sond detekteras genom elektronmikroskopi EM är ett effektivt alternativ. Detta är en optimal lösning, särskilt om probe går in i endocytic vägen på ett tidsberoende sätt, vilket gör det möjligt att veta när det kommer att markera en specifik organell 6.
Upptaget av positivt laddade nanoguld genom jäst sfäroplaster (dvs.. Jäst där cellväggen har enzymatiskt avlägsnas) har framgångsrikt använts för att identifiera jäst endosomala fack 10. Dessa partiklar binds kraftigt till de negativt laddade lipider som utgör de biologiska membranen. Således de positivt laddade nanoguld associerar med PM, penetrerar cellen genom endocytos och passerar genom EE och LE innan vakuolen. Dessa små guldpartiklar, men inte har en lämplig storlek för att ses av EM. För att göra dem synliga, kan deras storlek förstoras genom kemiska reaktioner som leder till avsättning av silver eller guld runt guldsonden 13-15. Vi har utvecklat och framgångsrikt tillämpat ett IEM strategi baserad på Tokuyasu metoden att utföra subcellulärlokaliseringsstudier 8,16. Denna metod gör det möjligt att utföra immunogold märkning på jästpreparat med en utmärkt upplösning på morfologin 8,17-24. Vi har också etablerat ett förfarande som kombinerar denna IEM protokoll med nanoguld märkning av jäst endosomal systemet fack 6. Med hjälp av denna metod har vi morfologiskt karakteriseras olika underklasser endosomes och ultrastrukturellt undersökt mutanter med en endosomal handeln defekt 6,25. Dessutom har vi visat att denna nanoguld märkningen kan kombineras med immunogold labelings ger möjlighet att undersöka fördelningen av ett protein av intresse om de olika endosom delpopulationer. Här presenterar vi hur märkning av jäst endosomal system med positivt laddade nanoguld är praktiskt utförs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-elektronmikroskop är en teknik som gör det möjligt att kombinera lokalisering av proteiner med den ultra upplösning av bärarna och organeller där dessa proteiner är bosatta. Detta är särskilt viktigt när man studerar jäst endosomal systemet eftersom dess fack visas som punktera strukturer i fluorescensmikroskopi. Det är därför svårt att skilja dem åt. Av detta skäl har användningen av en sond detekteras genom EM och skriva in den endocytiska vägen på ett tidsberoende sätt är avgörande för …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar René Scriwanek för hjälp med förberedelserna av figuren. FR stöds av ECHO (700.59.003), ALW Open Program (821.02.017 och 822.02.014), DFG-NWO samarbete (DN82-303) och ZonMW VICI (016.130.606) bidrag.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
