खमीर, Saccharomyces cerevisiae, endosomal प्रणाली की जीवजनन और कार्यों को विनियमित जीन की पहचान और अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव किया गया है. यहाँ हम ultrastructural पढ़ाई के लिए endosomal डिब्बों की विशिष्ट लेबलिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे.
Endosomes कोशिकाओं में चौकियों छँटाई प्रमुख झिल्ली में से एक हैं और वे ज्यादातर प्लाज्मा झिल्ली और Golgi से प्रोटीन की रीसाइक्लिंग या विनाश को विनियमित. नतीजतन endosomal प्रणाली सेल homeostasis को बनाए रखने में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, और vesicular परिवहन से जुड़े organelles के इस नेटवर्क से संबंधित जीन में उत्परिवर्तन, कैंसर और neurobiological विकारों सहित गंभीर विकृतियों का कारण. यह endosomal प्रणाली की जीवजनन और संगठन अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए इसलिए प्रधानमंत्री प्रासंगिकता की है. खमीर के इस कार्य में निर्णायक रही है. विशेष रूप से लेबल और ultrastructural स्तर पर इस मॉडल जीव के endosomal प्रणाली का विश्लेषण करने के लिए, हम यहाँ एक चांदी वृद्धि की प्रतिक्रिया के माध्यम से इन कणों के दृश्य द्वारा पीछा स्फेरोप्लास्ट द्वारा सकारात्मक आरोप लगाया nanogold तेज के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. इस विधि को भी एक मूल्यवान भी हैendosomal तस्करी में दोष के साथ म्यूटेंट की रूपात्मक परीक्षा के लिए एल. इसके अलावा, यह न केवल ultrastructural परीक्षाओं के लिए लागू है, लेकिन यह भी प्रोटीन स्थानीयकरण जांच के लिए immunogold labelings के साथ जोड़ा जा सकता है.
endosomal प्रणाली 1,2 रिसेप्टर्स lysosomal एंजाइम छँटाई रिसेप्टर्स की तस्करी और प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) के पुनर्चक्रण सहित कई महत्वपूर्ण सेलुलर भूमिका निभाता है कि एक प्रमुख झिल्ली छँटाई तंत्र है. Endosomes तीन अलग डिब्बों, अर्थात् में विभाजित हैं. जल्दी endosomes (ई), देर endosomes (ले) और पुनर्चक्रण endosomes. इस वर्गीकरण में यह विशिष्ट मार्कर प्रोटीन पर और उनके आकारिकी पर, उन तक पहुँचने के लिए endocytosed सामग्री के लिए लगने वाले समय पर आधारित है. PM से भली भाँति झिल्ली, यानी प्रोटीन और लिपिड bilayers, या तो गिरावट के लिए endosomes माध्यम लाइसोसोम के लिए दिया जा सकता है या वापस पुनर्नवीनीकरण किया. झिल्ली भी लाइसोसोम को जारी रखने या वापस Golgi को पुनः प्राप्त किया, या तो इसी Golgi से endosomes के लिए ले जाया जाता है. इसके अलावा, प्रोटीन endosomal सीमित झिल्ली के गठन की ओर जाता है कि एक प्रक्रिया से आवक नवोदित luminal vesicles में हल किया जा सकता हैले के एक उपश्रेणी, multivesicular निकायों.
खमीर endosomal प्रणाली अपेक्षाकृत कम जटिल उच्च कोशिकाओं में से एक से अधिक है. खमीर endosomes ई और ले में विभाजित हैं. वे पुनर्चक्रण endosomes लेकिन यह भी ऊतक विशेष लाइसोसोम से संबंधित organelles शामिल नहीं है स्तनधारी कोशिकाओं के विपरीत. नतीजतन वे endosomal तस्करी मार्गों 3,4 की एक कम जटिल नेटवर्क है. इसलिए खमीर का प्रतिनिधित्व किया और अब भी endosomal प्रणाली में सिद्धांतों अंतर्निहित झिल्ली यातायात के कुछ अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद प्रायोगिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व किया है. यह लाभ endosomal रास्ते में शामिल कई जीनों शुरू में खमीर 5 में आनुवंशिक स्क्रीन के साथ पृथक किया गया है कि इस तथ्य से बल दिया है. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती कोशिकाओं में खमीर endosomal प्रणाली में बड़े पैमाने पर जैव रासायनिक और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण का उपयोग कर अध्ययन किया गया है, वहीं ultrastructural स्तर पर इसकी जांच ही कर दिया गया हैकम से कम. Endosomal organelles से ज्यादातर ने अपने स्पष्ट पहचान 6 मुश्किल बना जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा बीच में रोकना संरचनाओं, के रूप में पहचान कर रहे हैं क्योंकि रूपात्मक विश्लेषण खमीर में विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. दुर्भाग्य से खमीर endosomal प्रोटीन मार्कर पहचानने antisera का केवल एक सीमित संख्या (आईईएम) की तैयारी 7-10 इम्युनो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में काम कर रहा है. कुछ प्रोटीन के लिए, इस समस्या हित के जीन की अंतर्जात टैगिंग और यह 7,11,12 पता लगाने के लिए टैग पहचानने एक एंटीबॉडी का उपयोग करके उन्हें धोखा दिया गया है. अक्सर, हालांकि, प्रोटीन, क्योंकि उनके कम अभिव्यक्ति के स्तर की आईईएम द्वारा undetectable हैं. इस दृष्टिकोण organelle आकारिकी / कार्यों में गलत localizations और / या परिवर्तन पैदा कर सकते हैं क्योंकि उनके overexpression एक समाधान नहीं है. इस प्रकार इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ईएम द्वारा detectable एक जांच के साथ endocytic डिब्बों की लेबलिंग एक कारगर विकल्प है. यह विशेष रूप से अगर एक इष्टतम समाधान है जनसंपर्कओबीई यह एक विशिष्ट organelle 6 प्रतीक होगा जब पता करने के लिए अनुमति देता है जो एक समय पर निर्भर ढंग से endocytic मार्ग, प्रवेश कर रहा है.
खमीर स्फेरोप्लास्ट (सेल दीवार enzymatically हटा दिया गया है, जहां यानी. खमीर) द्वारा सकारात्मक आरोप लगाया nanogold के तेज सफलतापूर्वक खमीर endosomal 10 डिब्बों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन कणों को दृढ़ता से जैविक झिल्ली रचना नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड करने के लिए बाध्य. इस प्रकार प्रधानमंत्री के साथ सकारात्मक आरोप लगाया nanogold एसोसिएट्स, endocytosis द्वारा सेल प्रवेश और रिक्तिका तक पहुँचने से पहले ई और ले के माध्यम से गुजरता है. इन छोटे सोने के कणों, तथापि, ईएम द्वारा देखा जा करने के लिए एक उचित आकार नहीं है. उन्हें दिखाई प्रस्तुत करना, उनके आकार सोने जांच 13-15 के आसपास चांदी या सोने का बयान करने के लिए नेतृत्व कि रासायनिक प्रतिक्रियाओं द्वारा विस्तारित किया जा सकता है. हम विकसित किया है और सफलतापूर्वक subcellular प्रदर्शन करने Tokuyasu पद्धति पर आधारित एक आईईएम दृष्टिकोण आवेदन किया हैस्थानीयकरण 8,16 अध्ययन करता है. इस विधि आकारिकी 8,17-24 का एक उत्कृष्ट संकल्प के साथ खमीर की तैयारी पर immunogold लेबलिंग प्रदर्शन की अनुमति देता है. हम भी 6 डिब्बों खमीर endosomal प्रणाली की nanogold लेबलिंग के साथ इस आईईएम प्रोटोकॉल के संयोजन एक प्रक्रिया की स्थापना की है. हम आकृति विज्ञान दोष 6,25 एक endosomal तस्करी के साथ म्यूटेंट endosomes के विभिन्न उपवर्गों की विशेषता और ultrastructurally की जांच की है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग करना. इसके अलावा, हम इस nanogold लेबलिंग immunogold labelings अलग endosome subpopulations पर ब्याज की एक प्रोटीन का वितरण का पता लगाने के लिए संभावना प्रदान करने के साथ जोड़ा जा सकता है कि प्रदर्शन किया है. यहाँ हम सकारात्मक आरोप लगाया nanogold साथ खमीर endosomal प्रणाली की लेबलिंग व्यावहारिक रूप से किया जाता है कैसे प्रस्तुत करते हैं.
इम्यूनो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इन प्रोटीनों रहते हैं जहां वाहक और organelles की ultrastructural संकल्प के साथ प्रोटीन के स्थानीयकरण के संयोजन की अनुमति देता है कि एक तकनीक है. इसके डिब्बों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्क?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों चित्रा की तैयारी के साथ सहायता के लिए रेने Scriwanek धन्यवाद. एफआर ALW खुले कार्यक्रम (821.02.017 और 822.02.014), DFG-NWO सहयोग (DN82-303) और ZonMW VICI (016.130.606) अनुदान, इको (700.59.003) द्वारा समर्थित है.
PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |