Un guide pour In vivo Simple unité d'enregistrement de Optogenetically identifié corticale inhibitrice Interneurones

Résumé

Nous décrivons ici notre stratégie pour obtenir des enregistrements unitaires stables et bien isolés à partir d’interneurones inhibiteurs identifiés dans le cortex de souris anesthésié. Les neurones exprimant ChR2 sont identifiés par leur réponse à la lumière bleue. La méthode utilise un équipement d’enregistrement extracellulaire standard et constitue une alternative peu coûteuse à l’imagerie calcique ou au patching guidé visuellement.

Résumé

Un défi majeur dans la neurophysiologie a été de caractériser les propriétés de réponse et la fonction de nombreux types de cellules inhibiteur dans le cortex cérébral. Nous partageons ici notre stratégie pour obtenir stables, bien isolées enregistrements unitaires de interneurones inhibiteurs identifiés dans le cortex de souris anesthésiée à l'aide d'une méthode développée par Lima et ses collègues ^1. Les enregistrements sont effectués dans des souris exprimant channelrhodopsin-2 (ChR2) dans les sous-populations neuronales spécifiques. Les membres de la population sont identifiés par leur réponse à un bref éclair de lumière bleue. Cette technique - appelée «PINP", ou identification Photostimulation assistée de neurones populations - peuvent être mises en œuvre avec l'équipement d'enregistrement extracellulaire standard. Il peut servir comme une alternative peu coûteuse et accessible à l'imagerie de calcium ou patch visuellement guidé, dans le but de cibler des enregistrements extracellulaires de cellules génétiquement déterminées. Havant que nous fournissons un ensemble de lignes directrices pour l'optimisation de la méthode dans la pratique quotidienne. Nous avons affiné notre stratégie spécifiquement pour cibler des cellules de parvalbumin positif (PV +), mais nous avons trouvé que cela fonctionne pour d'autres types de interneurones ainsi, comme (CR +) interneurones Calretinin exprimant la somatostatine exprimant (SOM +) et.

Introduction

La caractérisation de la myriade de types de cellules qui composent le cerveau des mammifères a été un objectif central, mais longtemps insaisissable de la neurophysiologie. Par exemple, les propriétés et la fonction des différents types de cellules inhibitrices dans le cortex cérébral sont des sujets de grand intérêt mais sont encore relativement inconnus. Cela s’explique en partie par le fait que les techniques conventionnelles d’enregistrement in vivo à l’aveugle sont limitées dans leur capacité à distinguer les différents types de cellules. La largeur de pointe extracellulaire peut être utilisée pour séparer les neurones inhibiteurs présumés positifs à la....

Protocole

REMARQUE: Le protocole suivant est en conformité avec les Instituts nationaux de la santé des lignes directrices approuvées par l'Université de l'Oregon de protection des animaux et l'utilisation Comité.

1. Chirurgie aiguë

1. Anesthésier l'animal avec un cocktail de kétamine-médétomidine, par voie intrapéritonéale (ip) injection (tableau 1).
   REMARQUE: Les souris utilisées dans ces expériences sont générées par croisement d'une CHR2-EYFP transgénique ligne 10 cre dépendant de interneurone lignes d'attaque (Pvalb-iCre11, PV +; Sst-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Livraison virale de Ch....

Résultats

Nous ici partageons notre stratégie pour obtenir des enregistrements unitaires de interneurones inhibiteurs génétiquement petites dans le cortex de souris anesthésiée, en utilisant une méthode optogenetic développé par Lima et al. Tableau 1 détaille le cocktail anesthésie suggéré, la kétamine-médétomidine-acépromazine ^(1. " KMA "). La figure 1 illustre une micro-électrode de tungstène, préparée pour l'enregistrement. La figure 2 présente un schéma de.......

Discussion

Bien PINP est conceptuellement simple, il peut être difficile dans la pratique. Un facteur déterminant de la réussite est le choix de l'électrode. Le rayon d'écoute électrique est le paramètre critique. Il doit être suffisamment grand pour détecter les pics de lumière évoquée lorsque la pointe est encore loin d'une cellule ChR2 +, de sorte que l'on peut régler la vitesse d'avance en conséquence. Dans le même temps, elle doit être limitée suffisamment bonne pour permettre l'isolement unitaire. Aut.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural crochet)	FST	10066-15
Ciseaux chirurgicaux	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (poignée), 10011-00 (lames)
Puralube Pommade ophtalmique	Foster & Smith	9N-76855
Couverture homéothermique Appareil de	Harvard	507220F
Microélectrodes en tungstène	A-M Systems	577200	12 M&Omega ; Résistance AC, 127 &mu ; m de diamètre, 12° ; Tube en verre capillaire revêtu d’époxy
Warner	Instruments	G150TF-3
HeatShrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	À utiliser avec la Super Glue standard.  ;
Microélectrode AC Amplificateur 1800	AM Systems	700000
MP-285 Micromanipulateur motorisé	Sutter	MP-285
Oscilloscopes numériques 4 canaux	Tektronix	TDS2000C
Haut-parleurs amplifiés	Harman	Modèle JBL  ; Manipulateur manuel Duet
	Scientifica	LBM-7
800 µ ; m Câble de raccordement à fibre optique	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Capteur	de puissance ThorLabs	PM100D (capteur de puissance), S121C (capteur de puissance standard)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	La puissance et l’efficacité des LED augmentent constamment, nous vous recommandons donc de rechercher les derniers produits (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND