نموذج رواية خفيفة إصابات الدماغ للالجرذان الأحداث

Summary

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Abstract

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

Introduction

على الرغم من أن هناك العديد من الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتوليد متوسطة إلى شديدة إصابات في الدماغ (TBI)، وقد وضعت عدد قليل جدا من التقنيات للحث خفيفة، أغلقت إصابات الرأس في القوارض. ونظرا لحقيقة أن خفيفة إصابات في الدماغ (MTBI) هو ثلاث مرات أكثر شيوعا من المتوسطة والشديدة إصابات الدماغ مجتمعة ^1، هناك حاجة إلى نموذج موثوق من MTBI لتسهيل البحث بشأن الفيزيولوجيا المرضية والنتائج العصبية الحيوية والسلوكية، والاستراتيجيات العلاجية. على سبيل المثال، بسبب جزئيا إلى القيود المفروضة على النماذج الحيوانية الحالية ^2، في العقد الماضي كان هناك أكثر من 200 التجارب على الأدوية الفاشلة لعلاج TBI ^3. عندما يتم إنشاؤها الأنظمة النمذجة للدراسات بحثية متعدية، انطباق النتائج تعتمد على صلاحية النموذج تنفيذها. لدراسة MTBI / ارتجاج، فإن نموذج حيواني موثوق لا تحاكي إلا القوات respon النشاط الحيويالمنال للإصابة المسببات، ولكن من شأنه أيضا أن يحفز أعراض تتفق مع تلك التي ذكرت من قبل السكان ذات الصلة سريريا. وعلاوة على ذلك، لأن الأطفال هم عرضة بشكل خاص للMTBI، فإن نظم النمذجة المثلى أن تنطبق على القوارض الشباب والأحداث، بالإضافة إلى مكافئات الكبار.

التحليلات النشاط الحيوي من الظروف التي الرياضيين قد أصيب mTBIs أو إصابات الدماغ الارتجاج تشير إلى أن العوامل التنبؤية الأكثر أهمية للإصابة هي تسارع الرأس السريع والآثار سرعة عالية ^4. غالبية نماذج القوارض المستخدمة حاليا لتحريض TBI تسمح حركة ضئيلة أو معدومة من الرأس ⁵ (للمراجعة انظر ^2). نموذج المذكورة هنا، يسلم له تأثير عالية السرعة في الرأس من الفئران الأحداث غير المقيد جسديا الذي يرافقه 180 درجة دوران والسقوط الحر الذي ينطبق قوات تسارع / تباطؤ لرأس موضوع والجسم. تيوهنا اثنين من المزايا الرئيسية المرتبطة مع هذه التقنية انخفاض الوزن المعدلة للتحريض MTBI. أولا، فإن النموذج ينتج الارتجاج ذات الصلة سريريا مثل symptomology دون التسبب في أي ضرر العلني إلى الدماغ (للحصول على وصف كامل للنتائج السلوكية الاطلاع على ^6). يتفق أيضا مع التقارير السريرية لمتلازمة ما بعد الارتجاج، وتنتج هذه التقنية الوزن الإفلات تعديل نتائج غير متجانسة. على الرغم من أن الآثار من MTBI كبيرة، هناك تباين كبير بين القوارض التي شهدت MTBI عندما بحثت عن التدابير نتائج متعددة. ثانيا، يسمح طريقة دراسة MTBI المتكررة ^7. وبما أن غالبية نماذج المصرف التجاري العراقي الحالي تلحق مثل هذه الإصابات الشديدة، غالبا ما يكون من الصعب للحث على الإصابة الثانية، والمستحيل تقريبا لدراسة TBI المتكررة دون أضرار واسعة النطاق إلى القشرة بأكملها.

ولذلك، فإن الأساس المنطقي الأساسي لاستخدام تقنية انخفاض الوزن المعدل لايندوction من MTBI هو إنتاج الاصابة التي تمثل أكثر عن كثب الفيزيولوجيا المرضية وsymptomology من ارتجاج ومتكررة TBI في السكان الأحداث. مع تزايد حالات MTBI المتعلقة الرياضية، السقوط، وحوادث السيارات، وخاصة خلال مرحلة الطفولة، وهذا النموذج القوارض فريد من MTBI يوفر للباحثين أداة قيمة لدراسة إصابات الدماغ مثل الارتجاج التي يمكن تطبيقها بسهولة على ضرب متعددة نماذج.

Protocol

وأجريت جميع التجارب وفقا للمجلس الكندي للرعاية الحيوان وتمت الموافقة من قبل جامعة كالجاري، الحيوان جنة الأخلاقيات الرعاية: ملاحظة. 1. تربية وإعداد الحيوان ترتيب الفئران الحوامل من الموردين الحيوان مختبر القياسية أو الجراء تولد في المنزل وفقا لبروتوكولات تربية القياسية. منزل جميع الحيوانات مع libitum الإعلانية الحصول على الغذاء والماء، في درجة الحرارة للرقابة فأر غرفة السكن (21 ° C)، وهذا هو الحفاظ على ضوء 0:12 ساعة: دورة الظلام. عندما تصل الجراء بعد الولادة اليوم 21 (P21)، فطم الجراء من أمهاتهم ومنزل في مجموعات من نفس الجنس من 3 أو 4. 2. تعيين ما يصل من خفيفة إصابات الدماغ (MTBI) جهاز قبل بدء الإجراء، والأوزان مطحنة إلى كتلة المطلوب (على سبيل المثال 150 غ). آمن إرفاق حلقة معدنية لنهاية أعلى من وزن السماح للخط الصيد ليكون فايxed للوزن. يسجل رقائق القصدير بشفرة حلاقة حادة. تأكد من أن رقائق القصدير وسجل يدعم وزن الجسم من الفئران ولكن لن تتداخل مع تسارع من الفئران التالية تأثير الرأس مع الوزن. الشريط رقائق القصدير وسجل لمرحلة U على شكل مصنوعة من البلاستيك واضح (38 × 27 × 27 سم 3) الذي يحتوي على اسفنجة جمع (38 × 25 × 15 سم 3) (الشكل 1)، بحيث يكون مشدود. ضع مرحلة البلاستيك على شكل حرف U في الموضع الصحيح تحت أنبوب دليل مصنوعة من البلاستيك الشفاف. عقد أنبوب دليل البلاستيك (2.2 سم القطر × 1.5 م) في مكان مع موقف المشبك ووضع أنبوب دليل بحيث يكون 3.5 سم فوق رقائق القصدير وسجل. نعلق خط الصيد خلال حلقة معدنية لوزن ضمان أن الجزء السفلي من وزن معلقة بحرية 2.5 سم فوق رقائق القصدير وسجل. نعلق بشكل آمن خط الصيد إلى موقف المشبك. ملاحظة: الربط الوزن إلى الكتومص موقف على ارتفاع 2.5 سم فوق رقائق القصدير يمنع إعادة إصابات بينما الفئران تسقط من تأثير على الاسفنجة جمع). سحب وزن يصل من خلال دليل أنبوب بلاستيكي مع خط الصيد والاحتفاظ بها في مكان مع دبوس رئيسيا ألين في 1.0 متر. 3. تحريض MTBI عندما تصل الفئران P30 أقفاص الخطوة إلى غرفة الإجرائية. وضع الفئران في غرفة الأيزوفلورين وتخدير طفيفة الفئران حتى أنها غير قابلة للاستجابة إلى مخلب أو قرصة الذيل. وضع بسرعة الفئران الصدر لأسفل على رقائق القصدير وسجل مع رئيسها مباشرة في مسار الوزن السقوط. انظر الشكل 2. إذا بدأ الفئران على نقل أو للاستيقاظ قبل أن توضع على رقائق القصدير يسجل هدف العودة إلى غرفة الأيزوفلورين حتى غير استجابة لمخلب أو قرصة الذيل والبدء من جديد. سحب دبوس رئيسيا ألين، والسماح للوزنا ليسقط عموديا من خلال دليل أنبوب بلاستيكي وضرب الفئران على رأسه. عشرسوف الفئران البريد الخضوع بسرعة 180 درجة دوران والأراضي في موقف ضعيف. على الفور إزالة الفئران من الاسفنج جمع وتطبيق يدوكائين موضعي لرأس فأر مع القطن يميل قضيب. وضع الفئران في موقف ضعيف في قفص النظيفة التي يتم تسخين عن طريق وضع ذلك على وسادة التدفئة المتاحة تجاريا. باستخدام ساعة توقيت أو توقيت رقمي اكتساب "مرة وإلى اليمين". الوقت للوصول الى الحق هو الوقت الذي تستغرقه الفئران لايقاظ من مخدر والوجه من موقف ضعيف إلى وضعية الانبطاح أو البدء في المشي. العودة الفئران على له في قفص المنزل بعد أن تعافى السلوك العادي (الاستمالة، والمشي، واستكشاف، وغيرها). كرر الخطوات من 3،2-3،8 لكل الفئران الإضافية التي تتطلب MTBI. كرر الإجراء على نفس الفئران عند نقاط زمنية متعددة للتجارب MTBI المتكررة. 4. الحث للإصابة الشام بخفة anesthetize الفئران مع isoflurane حتى أنها غير قابلة للاستجابة إلى مخلب أو قرصة الذيل. وضع بسرعة الفئران الصدر لأسفل على رقائق القصدير وسجل مع رئيسها مباشرة في مسار الوزن السقوط. إزالة الفئران من رقائق القصدير دون سحب دبوس رئيسيا ألين من دليل أنبوب بلاستيكي وتطبيق يدوكائين موضعي في الرأس من الفئران مع القطن يميل قضيب. وضع الفئران في موقف ضعيف في قفص النظيفة التي يتم تسخين عن طريق وضع ذلك على وسادة التدفئة المتاحة تجاريا. استخدام ساعة توقيت أو توقيت رقمي للحصول على "مرة وإلى اليمين". العودة الفئران على له في قفص المنزل بعد أن تعافى السلوك العادي (الاستمالة، والمشي، واستكشاف، وغيرها). 5. التأكيد من MTBI مع شعاع المشي اختبار 8 24 ساعة بعد تحريض من MTBI أو صورية الحيوانات عودة الإصابة إلى غرفة الإجرائية. نقل الفئران إلى عقد قفص نظيفةووضع الفئران في المنزل قفص في نهاية أضيق من 165 سم مدبب شعاع مثل أن الجزء المفتوح للقفص المنزل يواجه نهاية أضيق من الحزم. ملاحظة: شعاع مدبب هو 165 سنتيمترا. منصة مركز شعاع لديها عرض 6 سم في نهاية اسعة و 1.75 سم في نهاية الضيقة. شعاع المركز لديه الحواف (2 سم و 2 سم تحت شعاع وسط) التي توفر السلامة عند زلات القدم على الفئران. ضع رغوة الحشو تحت شعاع للحد من خطر إصابة الفئران التي قد تقع قبالة شعاع أثناء الاختبار. وضع كاميرا فيديو في نهاية واسعة من شعاع مدبب وموقف / تكبير كاميرا الفيديو للتأكد من أن المحقق مشاهدة شريط الفيديو يمكن أن نرى بوضوح تحركات الفئران لطول شعاع مدبب. وضع الفئران في نهاية واسعة من شعاع مدبب وتشجيعها على السير عبر شعاع لله في قفص المنزل. وبمجرد أن الفئران يعبر شعاع مدبب، وترك الفئران في قفص له في المنزل لمدة لا تقل عن 60 ثانية إلى reiنفورسي موقع الهدف. هذا هو محاكمة # 1 وغير المدرجة في التحليل. تحويل كاميرا الفيديو على والسماح الفئران لإكمال المهمة شعاع المشي 4 مرات إضافية (الحفاظ على فترات التعزيز 60 ثانية في قفص المنزل). وبمجرد الانتهاء من الفئران جميع المحاكمات، والعودة الفئران على في قفص المنزل. للتسجيل تسجيل عدد من الخلفيتين الساق القدم زلات التي تحدث والوقت / المدة لعبور شعاع، لكل محاكمة الفردية. استخدام هذه البيانات لحساب متوسط ​​عدد الخلفيتين الساق القدم زلات والوقت لعبور شعاع لكل الفئران.

Representative Results

تقنية الوزن الإفلات تعديل المذكورة أعلاه هي وسيلة يمكن الاعتماد عليها للتحريض خفيفة إصابات في الدماغ (MTBI) في الفئران الأحداث. استخدام وزن تأثير 150 غ، وقد تم تطبيق هذه التقنية بنجاح للفئران الأحداث التي تتراوح 50-120 غ. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الإجراء يمكن أن تتكرر بسهولة في نفس الحيوانات لدراسة المتكررة MTBI. على الرغم من أن الحيوانات التي تعاني من MTBI معرض واحد زيادة في الوقت إلى اليمين (الشكل 3) وتظهر فاجأ عند الاستيقاظ، واستئناف الأنشطة العادية بسرعة وهي تمييزه بالعين المجردة من الحيوانات بجروح صورية. وبالنظر إلى أن الإصابة خفيفة، ليدوكائين موضعي الذي يلغي أي الألم الذي يصاحب تأثير نظرة عابرة، هو مسكن الوحيد المطلوب. وهذا أمر مهم للبحث كما هي معروفة الأدوية الألم لتتداخل مع عمليات التهابات والانتعاش نموذجية. ونظرا لعدم وجود symptomology العلني، فإن المهمة شعاع المشي هي موثوقة لرأ التي يمكن استخدامها للتحقق من صحة الاستقراء من MTBI. ومن المهم أن نلاحظ، أنه ليست كل الحيوانات التي تعاني من MTBI سوف تظهر العجز على المهمة شعاع المشي، ولكن كمجموعة، الفئران الأحداث مع MTBI تظهر بشكل ملحوظ أكثر الخلفيتين الساق القدم زلات بالمقارنة مع الفئران الأحداث بسبب اصابة في الشام (الشكل 4). آخر السمة الرئيسية لهذه التقنية الوزن الإفلات المعدلة هي عدم وجود ضبط النفس تطبيقها على الفئران الأحداث أثناء الإصابة الاستقراء. قبل توجيه ضربة نظرة عابرة في الرأس تليها تسارع التناوب السريع والتباطؤ، وهذا النموذج يمثل بشكل وثيق قوات النشاط الحيوي نسبت إلى MTBI وارتجاج في المخ. عندما يتم تطبيق هذا الإجراء للفئران الأحداث أو فئران بالغة، ومعدلات وفيات منخفضة للغاية (7/202 الحيوانات الأحداث ~ معدل وفيات 3.4٪)، وكسر في الجمجمة ونزيف داخل الجمجمة نادرة بشكل استثنائي 6،7. بالإضافة إلى ذلك، فإن النموذج ينتج سي ذات الصلة سريرياmptomology. أظهرت القوارض الأحداث التي شهدت MTBI واحدة العجز في الميزان والحركية السلوكيات، جنبا إلى جنب مع العجز في وظيفة تنفيذية، وزيادة السلوكيات مثل الاكتئاب، والتفاعلات الاجتماعية غيرت 6،9. وبالمثل، عرض فئران بالغة أيضا التوازن والتنسيق العجز خفيفة أن التعافي مع مرور الوقت 7. وأخيرا، تحريض MTBI باستخدام هذا النموذج يتطلب الحد الأدنى من مخدر و لا تنطوي على إعداد الجراحية أو تختبئ في الجمجمة. وبالتالي لا متحيزة النتائج والآثار التهابات المناعية أو التباس الناجم عن جراحة أو تخدير. وعلاوة على ذلك، فإن الوقت الانتعاش السريع وعدم وجود جروح مفتوحة تمكن بدء نماذج اختبارات إضافية لتحدث بعد فترة وجيزة من القوارض تعاني من MTBI. الشكل (1): </strong > C التمثيل artoon من U على شكل مرحلة البلاستيك والإسفنج جمع مع جميع الأبعاد ذات الصلة. ويجب الحفاظ على مسافة 10 سم بين الاسفنجة جمع وأعلى مرحلة من البلاستيك لضمان الفئران الأحداث ديه ما يكفي من الوقت لاستكمال 180 تناوب °. الشكل 2: (A) تمثيل الفوتوغرافي من منصة إصابة الاستقراء. يتم وضع الفئران الأحداث الصدر لأسفل على رقائق القصدير وسجل حتى أن الرأس هو مباشرة تحت وطأة السقوط. (B) عرض جانب من منصة إصابة الحث. (C) مظاهرة التصوير من الوزن المستخدمة في تحريض من MTBI . تحميل / 51820 / 51820fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/> الشكل 3: التمثيل البياني للمتوسط ​​الاختلافات في الوقت المناسب إلى اليمين بين الفئران الأحداث التي شهدت MTBI واحدة والجرذان الأحداث التي شهدت إصابة صورية (* P <0.01) الفئران التي تلقت المعرض MTBI زيادة كبيرة في. مدة الوقت اللازم لأنفسهم الحق من موقف ضعيف. الشكل 4: التمثيل البياني للمتوسط ​​عدد الخلفيتين الساق القدم زلات عرضت على المهمة المشي شعاع من الفئران الأحداث التي شهدت MTBI واحدة والجرذان الأحداث التي شهدت إصابة صورية (* P <0.05).

Discussion

Reliable modelling systems are needed to effectively cultivate basic science research that has significant translational validity. In response to rising occurrences and popular media, the investigation of mTBI and concussion has become a priority in many disciplines. However, despite increased research, there have been only incremental improvements in therapeutic strategies and treatment options ³. This lack of progress may be partially due to a discrepancy between the modeling systems employed and actual injury etiology. The majority of studies utilized rodent models that failed to reproduce the important biomechanical forces and appropriate post-injury symptomology. The current human definition of mTBI specifies that the injury results from acceleration and deceleration forces associated with a blunt trauma ¹⁰. The modified weight drop technique described here is therefore an ideal model for the study of mTBI and concussion because it uses a glancing impact to cause rapid rotational acceleration and deceleration to the head of an unrestrained animal, mimicking the biomechanical forces identified in sports-related injuries and automobile accidents. In addition, this model is easily adapted to examine repetitive mTBI, a phenomena that is emerging as a serious medical and socioeconomic issue. Studies indicate that rodents may be exposed to a series of 10 distinct mTBIs with minimal mortality ⁷. Finally, the method is inexpensive and can be carried out rapidly, allowing for high-throughput examination of a many therapeutic compounds and treatment regiments.

Just as with any procedural technique, certain aspects of the protocol are particularly important to the generation of reliable results. First, the tin foil needs to be scored effectively. If the tin foil is not properly scored, the force imparted by the weight during the glancing impact will not be enough to propel the juvenile rat through the tin foil onto the collection sponge. In these situations, the rat will remain in the starting position (chest down on the tin foil) and the mTBI will result from the blunt trauma from the weight impacting the stationary head, not the rotational acceleration and deceleration desired. Second, during the induction of the mTBI and the sham injury, the level of anesthetic applied to each rat should be consistent. Owing to the fact that time-to-right is used as marker of mTBI, the researcher should try to ensure that animals receiving a mTBI and animals receiving a sham injury are exposed to similar levels of anesthetic. A major advantage to this technique over many other TBI procedures is the low level and duration of anesthesiology. However, the juvenile rat needs to be non-responsive to a toe or tail pinch to ensure they do not wake-up on the stage before the injury is induced. Finally, in order to maintain a consistent injury etiology, the positioning of the rat’s head is particularly important. Ideally the weight should impact the center of the dorsal surface of the head. Caution should be taken to avoid positioning the path of the weight too near the caudal/posterior portion of the head, as impacting the brainstem and cerebellum is associated with increased mortality and seizure activity.

Based upon the biomechanical pathophysiology of injury induction and the behavioural outcomes examined, the modified weight-drop technique appears to be a reliable model for the investigation of paediatric mTBI and concussion. Although preliminary studies of this novel model have assessed some basic molecular and structural changes ⁷ future studies will be needed to ascertain how the brain responds to a mTBI with this injury etiology. An in-depth analysis of the neuroanatomical and biological changes that occur at the cellular and epigenetic level would increase model validity and translational applicability. In addition to stimulating the generation of targeted pharmacological therapies, understanding the pathophysiological changes that occur in the brain in response to mTBI and concussion would also direct the research related to clinical biomarkers that have the ability to predict outcomes following injury.

Materials

Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad – 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory