在心肌细胞,管式膜结构形成细胞内的网络。我们描述了优化方案从小鼠心脏肌细胞I)的隔离,包括质量控制,二)活细胞染色国家的最先进的荧光显微镜,及iii)直接图像分析来量化成分的复杂性和膜细胞的可塑性网络。
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
在健康横纹肌细胞,管状膜结构与“横向”方向(T管)垂直于主细胞轴是丰富的。因此,T管已被定性为肌肉细胞主要的“横向”的表膜(肌膜)持续扩展,深入渗透朝小区中心的细胞质。的T管连续的外表面的膜的生理作用是通过SER细胞器接触结构域在整个较大的心肌细胞体积的电压活化的L-型Ca纳米邻近耦合形成远程胞内区室的快速电耦合离子通道(Cav1.2)内向电流(I Ca)的激活相邻兰尼碱受体(RyR2的)SER的钙离子释放。在交界SER域和T之间的心室肌细胞(虚拟机)中,非连续的膜的接触(“结”)-tubules被认为控制数千个体细胞内的 Ca 2 +释放纳米畴的每个单元1中。
对于任何给定的接触领域,在并置的膜的每个T形小管和外周(连接)的SER的部分是大约彼此接近15纳米,因此定义为nanodomain。因此,极个别小细胞质子空间隔离这使准小区自治仓行为。当传入的动作电位活化的T管虚拟机,一个相对较小的Ca Cav1.2 离子通道内向电流会迅速增加的子空间中钙离子浓度的钙离子浓度S IN的attoliter大小nanodomain 1。接下来,[ 钙 ] S增加激活钙离子门控的兰尼碱受体(RyR2的)中的并列SER膜纳米路口附近,并且这种耦合过程发生在所有电连接ð心肌细胞纳米畴。 RyR2s发生致密多通道簇的1 Cav1.2通道的估计的化学计量为5-10的RyR2通道2。由于SER到胞浆钙离子浓度梯度很陡(10比4:1)和RyR2s作为高电导钙离子的功能结合型集群的释放渠道,在数量上大RyR2的钙激活导致2 +释放的T小管加上交界的SER域增加局部子空间的[Ca 2 +] S以100微米或更高在1-2毫秒3,4电流。这种心脏信号放大行为也被称为钙离子诱导的Ca 2 +释放(CICR)。总之,T管是必要的膜结构,可以快速激活兴奋收缩(EC)的耦合过程中通过交界nanodomain SER的接触和细胞性CICR 钙释放的信号。
除了T管,轴向细管S(A-小管)平行于主(纵向)细胞轴的显著不同的方向已经证实了通过电子显微镜(EM),共聚焦和双光子显微镜的研究。举例来说,肌原纤维相互连接的带T管附近肌Z-线之间的A-肾小管细胞的宽连续晶格所表现出细胞外示踪剂和固定豚鼠虚拟机5的EM图像。使用外葡聚糖联荧光素染色和生活大鼠虚拟机的双光子成像,复杂的三维网状小管网络中包含可视〜60%T管和〜40%,小管6。这项研究不仅导致了大量的A-小管三维可视化,同时也实现了切片的EM可视化本质上是有限的复杂和动态膜网络,如横向轴小管系统(TATS)的分析。因此,TATS膜的共聚焦活细胞成像直接沾上二8 ANNEPS开发。如果活细胞TATS网络由傅里叶变换分析,经常出现在靠近肌Z-线空间的T-细管部件是通过从条纹信号7的区域中的集合功率谱反射。这种间接的分析策略已经被用于检测在疾病模型7中TATS成分规律性小区宽的区域的变化。例如,shRNA的介导junctophilin-2击倒导致心脏衰竭和亚型特异性蛋白质不足造成的T小管重组与nanodomain 钙释放功能障碍8。我们通过直接定量方法,并进一步利用受激发射损耗(STED)纳米显微镜9在小鼠单独的虚拟机TATS组件的活细胞超高分辨率显微镜最近延长TATS膜网的分析。允许直接分析较小的单个TATS组件,其中接近50:50的横向分布的纳米图像分辨率与小管的轴向方向,定量确定2丰富的差异还面向个人TATS在健康小鼠心脏9成分。这些策略将在下面的协议部分中进一步概述的。
而丰富的A-小管组成部分,在成人心脏的生理作用仍然神秘莫测,新兴市场的研究已经证明了A-小管提示内源性钙豚鼠和大鼠的VM 5,10释放纳米畴相关的SER膜结构。 Cav1.2和RyR2的共聚焦分析发现,高度共存的A-小管路口10。由于自发钙火花在大鼠虚拟机起源比较远的地方,从T管,通常会出现Z线条纹〜20%,有一个参数一直是A-小管相关的纳米畴可能确实存在,并作为钙释放位点11,12。有趣的是,T-细管形成和成熟OC只有出生后小人和P5平行心脏细胞, 例如生长,通过对前体肌膜内陷发芽和未成熟的支TATS网络组件在P10小鼠13。看来,Junctophilin-2是产后TATS网络成熟特别重要,因为的shRNA敲除抑制T型小管膜锚定到SER路口,导致延迟钙释放及病理TATS组织,在不成熟的A-小管为主的架构一致虚拟机13。这些意见最终可能导致验证性的概念,T管通过膜内陷的过程,而A-小管形成可变形通过额外的,甚至替代细胞内的机制14。
在心脏疾病TATS膜特性的变化已成为一个重要的研究领域病理生理问题。在起搏诱发心脏failu狗模型初步报告再次表明了T管和Cav1.2电流(I Ca)的 15亏损。缺血性心肌病的动物模型表现出减少的T小管密度和细胞内钙的减少同步离子释放16。采用自发性高血压大鼠(SHR)模型心脏衰竭中,T管的亏损与Cav1.2和RyR2的的减少nanodomain耦合关联由“RyR2的孤儿”所提出的机制7。的T管的亏损也已缺血,扩张型,肥厚型心肌病样17表明在人类的虚拟机。此外,增加了在A-肾小管报道,在人的扩张型心肌病18的组织切片。心肌梗死后,我们发现TATS重组小鼠虚拟机与T管对比显著降低差分机制中的A-小管组件9的增加。重要的是,改善了当地的膜对比,通过活细胞superre实现解决方案STED显微镜启用了详细的定量成分分析通过直接测量,这表明了A-小管与TATS网络长度的整体增加,复杂的分支9显著增殖。此外,还表明,运动训练可逆转大鼠的T-细管重塑后心肌梗死19和心脏再同步治疗可能导致反向的T管重构犬心房快速起搏诱导的心脏衰竭20。合在一起,无论是在患病的人和动物的VM以及潜在的治疗性干预的研究将可以说从高质量细胞分离程序和详细的定量分析策略受益在协议中所概述和下面的效果的部分。
此外,最近由侧面证明了对ATP敏感性钾通道的TATS膜贩运亚型21,考虑心房m是重要的yocytes(AMS)作为生物鲜明以及比较心肌细胞模型与虚拟机。 T管最近被记录在羊和人的肺泡22。目前的证据表明,存在于细胞上午几个T管,通常像羊和人类,而不是较大的哺乳动物在小型啮齿动物23。相反,虚拟机,在肺泡巨细胞内的 Ca 2 +释放出现从细胞表面传播通过向小区中心其导致标记的空间和时间的 Ca 2 +梯度23扩散发生。在这个框架内就阐明细胞内Ca2 +信号不稳的常见病,多发病形式的机制,如房颤24显得重要。总之,无论是上午和VM细胞的分离和分别用于健康和患病的心是常用的协议。只有当细胞分离做正确作为判断的足够的细胞质量的微观文件,AM和虚拟机的样品应该是CArried向前定量TATS分析。因此,下面的协议部分是极其依赖于高质量细胞从小鼠或其它物种接着活细胞显微术来分析完整TATS膜分离。正如前面所指出的,TATS膜的特性是有倾向的固定和编制文物6时,由于渗透压的改变细胞膜的变化,传统的光学显微镜9的分辨率限制,一个具有挑战性的研究领域。我们注意到,国家的最先进的最新协议,对人类肺泡大鼠虚拟机用于细胞培养的钙成像和膜片钳和隔离此前已发表 在该刊25,26。
虽然心肌细胞已被分离,并研究了几十年的32,最近一次检讨的结论是一致的高质量的心肌细胞的隔离仍然充满挑战27。这反映了主要的心肌细胞VIS-à-VIS缺乏共同的标准方法,共享的元数据,而透明细胞质量文件的隔离相对复杂的协议。细胞分离的协议通常是由单独的组定制,产生可变结果的细胞株,取决于个体模式设置( 例如 ,物种,年龄,并存心脏疾病),通常调整为特定的实验条件。在定量TATS膜的研究和协议这里提出,质量评估和文档的基本水平的情况下涉及单个细胞的膜结构容易出现代谢和隔离协议相关变动或共聚焦显微镜超高分辨率,无论是在上午或VM。重要的是,即使细胞株高产建议健康完好的细胞,研究人员需要记录和批判仔细判断每个细胞对抗与非特异性损害表面和TATS细胞膜的完整性,由于分离过程对由于不同类型的具体变化形态标准干预措施相比,控制的条件。在心肌细胞的分离的一个重要变量是一个给定的胶原酶大量的特定活性。以选择一组新的胶原酶,胶原酶几个样品的酶活性,应互相通过评估心肌细胞产率和质量,并根据制造商的说明书进行试验。理想情况下,一个新的大量的胶原酶是确定与类似于以前成功地使用大量的胶原酶活性(对可能的酶活性进一步评估是指在材料和方法表中的“胶原酶很多选择工具”)。牛逼阿肯一起的TATS膜的可视化定量方法严重依赖于细胞的分离和质量,反之亦然,心肌细胞隔离导致非特异性膜破坏记录在案的TATS显微镜应触发的隔离程序,严格审查和纠正。由于细胞分离质量和TATS膜的可视化和量化有着内在的联系,本文所讨论的协议,涵盖所有主要方面作为一个连续的策略。
一个额外的挑战和心脏研究中,细胞损伤和/或细胞损失的常见问题的发生是由于代谢损害的干预,例如 ,心肌梗死后如图9所示 ,还需要针对潜在的意外损坏,例如判断,下列过程中细胞分离忽视空气栓塞。从患病心脏的心肌细胞的分离可能导致额外的,显著细胞损失和降低细胞的产量。因此,对比例如果细胞的分离和计数是通过标准化的协议一致地施加控制和病态心脏之间分离的完整细胞的总数的ISON可以是有意义的。因此,重要的是通过适当的对照组,这反映了最佳的心肌细胞的分离的质量来判断细胞的完整性。重要的是,单个细胞的质量和健康与患病细胞与活细胞显微镜的分离过程中不慎损坏,可能显著影响TATS膜的网络分析。这里介绍的协议,在细胞的分离和胎膜完整的活细胞显微因此强调生理膜元件的完整性和稳定性。整个工作流被设计为一个连续的策略来实现并保持完好TATS膜元件同时排除损伤的细胞,因为这些将表现出隔离依赖性膜器物等破坏膜小管,卷材胶粘ê泡,并改变TATS网络错误地控制条件和损害进一步定量分析。反之,同样的策略是至关重要的与潜在的干预研究扰乱TATS膜,它主要取决于真正健康与同TATS膜变化真患病细胞之间进行有意义的比较对照。
此外,我们要解决的程序,实现了技术上更有挑战性的隔离上午细胞。尽管进步和改善的协议,它强调的是,这是不平凡重现虚拟机的高品质小区隔离,甚至不太可靠的肺泡是很重要的。这是由于整体产量较低AM的细胞,其中在细胞的分离,即使小的误差或变化可能导致完全的调幅细胞分离失败,而VM的细胞损伤轻微程度可能是在细胞悬浮液中不那么明显,由于相对高的细胞数字相比,PM。由于上午细胞可能成为ç分离后urved,通过几个感兴趣区分析可能是有利的根据步骤4.3所概述。继细胞分离步骤的详细过程,我们提供了一个协议,直接整合膜染色和共聚焦或TATS都为虚拟机和AMS网络的STED超分辨成像。这些协议使通过先前建立的参数定量分析和TATS膜的选择组件的分化。相比于虚拟机,三维组织和肺泡心房TATS网络功能的行为是目前还不了解。
该程序形象TATS膜在活细胞中(步骤3.1至3.7)的开发与商业焦(表材料/设备)和定制的受激发射损耗荧光显微镜9。以优化荧光图像生成和定量分析TATS显微镜设置,以下几点是具有普遍意义:
相反,这里介绍的直接分析的策略,描述TATS膜与疾病相关的变化以前的出版物中,使用了T型小管密度区域总读数定量策略16,17,或间接的区域战略基于傅立叶互感器纹状的膜的信号,以评估T-细管部件规律性7本署可能分析。相反,此处所描述的定量方法是直接关系到个人TATS组件,并提供了一些额外的参数,包括膜的网络性能和像的A-肾小管的百分数特定组件。此外,TATS网络密度可被量化为每ROI区域的整个提取骨架的归一化长度。三个单独的三联点数目,连续地连接小管组件可以用来作为TATS膜网络的分支的复杂性的度量。我们注意到,最小TATS组件的任何分析依赖于染色程序。根据我们的经验,800微升的50微米二8 ANEPPS解决方案,足以完成染色TATS网络,包含50000 VM 9细胞的细胞沉淀。但是,如果将细胞沉淀中含有心肌细胞的下数如果强大的荧光检测器是可用的,并且如果根据经验测试可以使用整体TATS网络分布的共焦成像,而不是最小的膜细节和量的变化是感兴趣的,低级的染料浓度。最后,所描述的分析编写的软件的宏可用于自动化图像处理步骤,以促进分析的更大的数据集,这对于不同的治疗组( 例如 ,药物),细胞类型之间的比较是特别有用的( 例如 ,AM与VM ),和病理生理干预( 例如 ,假与心肌梗死)。
为TATS网络的图像分析,主要步骤如下顺序应用:1)滚动的球背景减法(4.5.1),以除去在背景强度的空间变化; 2)局部对比度增强(4.5.2); 3)图像平滑(4.5.3); 4)统计区域合并(4.5.4); 5)定义图像二值化的阈值(4.5.6);和6)计算该骨架数据的(4.5.8)。的荧光TATS图像的骨架化过程中的一个关键步骤是在图6所示的图像的二值化的阈值相关联的步骤,最终确定被检测到表示底层TATS部件与从背景噪声确定错误可能的错误结构,其真正的膜结构。正确的阈值进行二值化图像分析,识别要与真实TATS膜结构,它依赖于足够高的信号 – 噪声(SNR)的各比值为共焦和超高分辨率显微镜方法对应。因此,足够的图像质量,应首先建立,随后结合单个细胞的质量包括亮场图像文件的关键判断,概括。替代方案,以适应图像分割协议对于给定的显微镜数据输出和/或物理iological问题包括图像去卷积和像“大津”或“ISO数据”作为ImageJ的插件,其他的阈值程序。不管最终的分割过程中,我们考虑了图像叠加的强制性质量控制步骤提取原始数据之间的比较。总之,个人的离体心肌细胞,足以染色细胞TATS膜,用于荧光成像参数优化,并提取骨架数据的叠加控制形态和膜的完整性都将有助于荧光TATS图像和定量结果的质量。
如果较大的物种比小鼠用于细胞的分离,该协议可以很容易地修改为适当的。为下一个较大的物种,大鼠心脏可插管的钝地下14套管(外2.1mm直径),并灌注以8毫升/分钟。显著年长或患病的心脏,可能需要更大的套管尺寸。在基因拉尔,心脏灌注可以或者由恒压例如进行,使用储层和主动脉之间或通过使用蠕动泵恒定流动的高1米水柱。用于从小型啮齿动物的心像小鼠和大鼠细胞分离恒定流可能是有利的,因为胶原酶消化最终将破坏冠状动脉阻力血管,导致过度的灌注速度漏出血管床将由恒定流的协议来控制到某种程度。与此相反,恒压灌注是有利的,如果监视的流量和正确的插管是一个优先,这是有利的干预模式具有改变血管阻力的行为,以及用于在细胞分离程序的培训。
如以上概述的,足够的细胞质量为内源性膜系统的定量研究很重要。然而,在心脏灌注和胶原酶消化众多因素CRitically影响细胞的分离,这不应该在协议优化和故障排除27被低估的质量。特别是,在给定的胶原酶大量的活性应为兴趣如心房或在执行前的实验真正研究建立隔离条件心室的特定组织被确定为保持在整个研究的剩余部分。此外,水的质量,pH值,温度,灌注设置的优化和清洗会无意中破坏污染物和栓塞的风险最小化,并有可能附加因素必须被监视,以在细胞分离建立最佳稳态条件。 BDM(2,3 – 丁二酮-肟)肌球蛋白ATP横桥可逆抑制剂的组织解剖和消化过程中是常用的,以维持心脏肌肉松弛,从而增加细胞分离物的产率。不过,调查人员需要吨ö意识到BDM可能施加导致脱靶效应,例如 ,在某些条件下33抑制钠 / 钙交换电流的非特异性磷酸酶的活性。对于一些实验中,可能有利的由II型肌球蛋白的心脏停搏液,抑制剂与肌球蛋白在微摩尔浓度的高亲和性然而这是,中毒性且相对昂贵的更换BDM,并且可以具有其他的脱靶效应。搁健康心肌不应显示在没有电刺激与这些细胞的任何收缩应被排除在进一步分析。另一方面,响应于在生理细胞外的 Ca 2 +浓度的电刺激心肌细胞的收缩和舒张,可用于建立正常的收缩行为作为一种附加措施来评估心脏疾病与健康控制功能单元的质量和/或反常的行为细胞。
<p class=“jove_content”>总之,对于单个细胞的分离和在此描述的定量图像分析的协议已被成功地应用在TATS膜网络的共焦和超高分辨率显微术中的VM 9和AM单元21以及用于微管网络在定量分析定心肌细胞(数据未示出)。的协议,这些和未来的应用可能会打开渠道,多种实验问题,如TATS膜在不同发育阶段的特征或相关膜蛋白或细胞器结构的联系TATS网络的分析,以发挥高度本地化的,特定的域信号功能在上午和VM细胞。The authors have nothing to disclose.
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Chemicals and enzymes | |||
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
Langendorff perfusion setup | |||
Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
Instruments | |||
42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |