変動試験により測定された若いサッカロミセス·セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞における突然変異率が異なる複製年齢の母細胞のための突然変異頻度を予測するために使用される。磁気ソーティングフローサイトメトリー予測さ突然変異周波数からの逸脱を識別するために、実際の突然変異頻度及び母細胞の年齢を測定するために使用される。
出芽酵母は、ゲノム不安定性のメカニズムと影響を調べるための優れたモデル系となっている。 DNA修復およびDNA損傷応答因子が十分に多様な種を超えて保存されているので、この酵母モデルから得られた情報は、ヒトを含む多くの生物に関連しています。しかし、S.サッカロミセス·セレビシエは、まだ完全には技術的な制約のために複製(有糸分裂)、年齢の増加と共に突然変異変化を蓄積する速度かどうかに対処するために使用されていない。例えば、マイクロマニピュレーションを通して酵母複製寿命の測定は、稀な変異の検出を禁止する細胞の非常に小さな集団を伴う。娘細胞の死を誘導することにより、集団における母細胞を濃縮するための遺伝的方法が開発されているが、集団サイズは依然として選択システムを危険にさらすランダム突然変異が発生する頻度によって制限される。現在のプロトコルは、磁気sortiを利用しています表現型の選択を介して稀な突然変異を定量化するために高齢の母親細胞の十分な大きさの集団を得るために表面標識酵母母細胞ngの。変動試験により測定された突然変異率、および突然変異頻度は、最初の若い細胞に対して確立や各種複製年齢の母細胞における突然変異の頻度を予測するために使用される。突然変異頻度は、次に、ソート母細胞のために決定され、母細胞の年齢は、細胞分裂中にそれらの細胞表面上に形成された芽の傷を検出する蛍光試薬で染色してフローサイトメトリーを用いて決定される。実験的に与えられた複製年齢の母細胞について観察された頻度に細胞分裂の数に基づいて予測された突然変異頻度の比較はその後の突然変異の蓄積率の加齢変化があるかどうかを識別することができる。この基本的なプロトコルのバリエーションは、特定の遺伝子機能の変化の影響を調査するための手段を提供するか、または複製老化中にゲノム不安定性のメカニズムに対処するために、突然変異の蓄積上の特定の環境条件。
酵母サッカロマイセス·セレビシエなどの微生物は、突然変異率を調査するための優れたモデルであるが、これらのモデルは、完全に細胞の有糸分裂熟成中変異の蓄積を調査するために利用されていない。核ゲノムにおける突然変異の蓄積は、遺伝子機能の1(または変動)進行性の喪失をもたらすことによって老化に寄与することが仮定されている。エージング中に突然変異の蓄積のメカニズムと影響を研究するために微生物系を使用する能力が大幅ため容易遺伝子系および微生物における稀な表現型の変化を定量化が容易で、このプロセスに影響を与える遺伝的および環境的因子の同定を加速する可能性がある。 DNA修復因子およびDNA損傷応答タンパク質は、十分に多様な種2を超えて保存され、そして生物の老化の根本的な類似性は、S.限り多様な生物のために同定されているセレビシエ ANそれは可能性が高いことを作るD哺乳類3は 、酵母における研究から得られた結果は、多くの生物の老化に関係するであろう。
Sに高齢化に関する研究サッカロミセス·セレビシエは加齢による老化や細胞の複製老化を測定する2高齢化のモデルを利用する。加齢による老化に起因栄養枯渇3に非分裂状態(定常期)にある酵母細胞集団における生存能力の進行性の喪失によって特徴付けられる。加齢による老化モデルでは、大きな細胞集団を容易に変異細胞のための表現型選択を行うために、このモデルで得られるので突然変異が、加齢4に蓄積することを実証するために使用されている。この場合には、突然変異の蓄積は、増殖シグナル伝達経路および酸化ストレス5によって影響されるようであり、これらの各要因は、多細胞真核生物3の老化の理解に関連する。複製老化モデルは、非対称ディビジのを悪用S.の間での連続した細胞世代3で発生する老化を調査するためのサッカロミセス·セレビシエ母と娘細胞。酵母複製老化は、多くの場合、マイクロ流体デバイス6,7酵母細胞の小集団のビデオ顕微鏡を通して母と娘細胞、またはより最近では、小集団のマイクロマニピュレーションにより測定された。リミテッド人口のサイズは、全ゲノム情報が単一細胞から得られた、または非常に高い周波数の遺伝的変化は8で測定されていない限り、分裂熟成中の突然変異の蓄積を調査するためのこれらのアプローチはあまり適しています。単一細胞の全ゲノム配列決定は、変異の蓄積を調査するため、実質的なデータセットを提供するが、表現型選択システムは、突然変異の蓄積のメカニズムを研究するために突然変異率を測定する手段を提供するという重要な利点を有する。 haploiにおける表現型の選択を介して突然変異頻度や料金を検討する研究複製老化の間のd個の酵母菌株は、まだ報告されていない。
突然変異率は、一般的に変動試験9を用いて測定される。変異頻度の値は、集団における遺伝子配列における変異を有する細胞の総数を反映する。これは独立した突然変異が発生した細胞単に既存の突然変異を継承するそれらの細胞の任意の子孫を含む。対照的に、変動試験により測定された突然変異率は、新たに、各セルの生成を生じる独立した突然変異の数を表す。これらのテストは、典型的には、標的配列内の既存の変異を有する細胞を添加ほぼ飽和した培養物を増殖し、選択培地上での増殖によって突然変異細胞を同定する可能性を低減するために低細胞密度で、多くの複製培養物を接種することを含む。レプリケート集団で同定された変異体細胞の数は、その後、iの数を推定するために、いくつかの数学的モデルのいずれかで使用されている成長の9時に生まれたndependentの突然変異。平均集団サイズに独立した変異の数を比較して突然変異率の尺度を提供する。 S.でこれらの遺伝子における機能喪失変異は、選択可能な表現型を生成するので、 サッカロミセス·セレビシエ 、突然変異頻度や料金は頻繁に、URA3及びCAN1遺伝子を用いて測定される。 URA3によりコードされたタンパク質は、毒性分子10内に5-FOAに変換するので、URA3機能の喪失は、5 -フルオロオロチン酸(5-FOA)に耐性の細胞をレンダリングします。 CAN1によってコードされるタンパク質が細胞11内にアルギニン及びカナバニンを搬送するので、CAN1の機能の喪失は、細胞がカナバニンに耐性になることができ、有毒なアルギニン類似体。
遺伝的および物理的な両方のソーティング戦略は成功しS.のより大きな集団を得るために使用されている複製老化の調査を容易にするために、 サッカロミセス·セレビシエ母細胞。遺伝的戦略は、集団の中の娘細胞の生存に対して選択する巧妙な手法を含む。母濃縮計画(MEP)loxP部位 12を含むように操作された2つの必須遺伝子の娘特有の混乱につながる唯一の娘細胞におけるCreリコンビナーゼの発現のベータ-エストラジオール誘導を伴う。 MEP株は誘導物質の非存在下では正常に成長させることができますが、母細胞が娘細胞が細胞周期から12彼らの最初の進行の間に、一般的なM期で逮捕する一方、誘導後に分裂していきます。このシステムは広く熟成中の変異の蓄積を研究するために使用されていないが、それは老化母細胞13,14におけるヘテロ接合性の消失、二倍体酵母株におけるゲノム不安定性の比較的頻繁な形態、ならびに生化学的変化を研究するために使用されている。同様に、娘避雷器システムは、Sの娘特異的発現を伴うcereviSIAE URA3遺伝子15。 5-FOAがれるURA3を発現しているポイントの娘細胞が死んでしまう、培地に添加されるまで、母細胞が15を成長させ続けている娘、アレスタ株は、正常に成長。これらは、母細胞を濃縮するための有用なシステムであるが、それらは選択システムを構成する遺伝子機能の維持に依存している。選択システムの1つまたは複数の構成要素におけるランダム変異は、選択を脱出し、指数関数的に増殖する娘細胞を生じる可能性がある。 MEP株の開発中に、適切な集団サイズは選択12を逃れる可能性突然変異娘細胞の出現を回避するために決定した。しかし、人口規模で、この制限は、複製老化の間にゲノム不安定性のまれな形態の検出を損なう。集団サイズに対するこの制限は、部分的にほとんどは、選択システムに貢献する各遺伝子の2つのコピーを二倍体酵母株を用いることによって克服することができ変異はおそらく12劣性となる。しかし、二倍体株の使用を容易に簡単に一倍体酵母細胞中で検出可能なものと比較して検出することができる突然変異事象の種類を制限する。
物理選別戦略は母細胞の大集団を濃縮するために、非標識の娘細胞からの標識細胞表面と母細胞の単離を含む。観察S.の細胞表面タンパク質(細胞壁タンパク質)が出芽は、彼らが16を産生する娘細胞を標識することなく母細胞を標識するために利用されてきた時にセレビシエ娘細胞が新たに合成される。例えば、ビオチンでその表面上に標識した酵母細胞の初期集団を成長させることができ、次いで、初期集団によって生成された娘細胞がその表面にビオチンを含有しないので、抗ビオチンマイクロビーズ、磁気選別16を使用して娘細胞から単離さ。シリアル成長とソートは、母細胞の漸進古い集団が得られ、分析されることを可能にする。この手順は、酵母13,14,17,18の複製老化の間の細胞生理学および遺伝子発現の変化を調べるために首尾よく使用されてきた。現在の方法は、潜在的にまれな変異または表現型の選択を介してアッセイしたゲノム不安定性の他の形態の蓄積を測定する目的で母細胞を濃縮するために、このビオチン標識および磁気選別技術を適応させる。シリアル成長および物理的ソートが漸進的により古い母細胞において、ならびにそれらの娘細胞集団における突然変異の蓄積の分析を可能にする。世代当たりの突然変異率の決定は、予測された変異頻度は、細胞分裂の特定の数を受けた母細胞のために計算されることを可能にする。予測された周波数値に起因観察mutatiにおける細胞分裂のさらなるラウンド、実質的な偏差に増加が予想に基づいていますので予測された値と比較した周波数での変異を蓄積率の年齢別の変更のための証拠を提供しています。このプロトコルを使用して、フローサイトメトリーによって分析と結合した母細胞における細胞分裂の部位に対応芽瘢痕の蛍光染色を迅速にソートされたおよび未選別集団の年齢分布を決定するために用いることができる。このような反応性酸素種を検出するために使用されるもののような付加的な蛍光試薬もまた、このプロトコルの間に使用することができる。全体的に、このプロトコルは、老化関連ゲノム不安定性に影響を与える遺伝的要因と環境要因を研究に非常に適したモデル生物において加齢に伴う細胞生理学的変化との相関の可能性を持つゲノム不安定性における年齢依存性変化の効率的な解析を可能にします。
このプロトコルは、リソースを有効にするために複数の方法を組み合わせて、効率的に有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性の研究に適用される出芽酵母モデル系で利用可能に近づく。表現型選択を介してゲノム不安定性の異なる形態を定量化するための多種多様なアッセイは、突然変異または染色体再配列の特定の形態の蓄積を可能年齢特異的な変化を研究するために、磁気選別と組み合わせることができる。全ゲノム配列決定アプローチは年齢とともにゲノムに生じる変化の全体的な種類の詳細な情報を提供できるが、突然変異率の測定値を得るために表現型の選択系を使用すると、優先的に遺伝子変化の特定のタイプを単離する能力は、機構的研究のための重要な利点である加齢に関連するゲノム不安定性の側面。細胞齢とphysiologiの並列測定を行う可能性の決定を合理化フロースルーCALの変化は、フローサイトメトリー、特定の年齢層の間に他の細胞の変化とゲノム不安定性を相関させる効果的な手段を提供する。蓄積変異の率の潜在的な年齢依存性の変化の測定が必要です。1)慎重に若い細胞集団における金利の決定、細胞齢の2)正確な決定、及び3)確実に再現性よく測定するために母細胞の十分に大きな集団を豊かにする機能老後のゲノム不安定性。このアプローチは、酵母モデル系は速度および/または有糸分裂活性細胞におけるゲノム不安定性の周波数の年齢依存性変化の原因基礎となるメカニズムを定義することに貢献することができます。さらに、遺伝的要因と環境要因が急速に年齢依存ゲノム不安定性への寄与について評価することができる。最終的には、これらの特徴付けは、変異が複製老化の間に蓄積される方法を考慮したモデルの開発につながる可能性があります。
この方法は、そのような事象の発生率を測定するために選択可能な表現型の出現を通して突然変異またはゲノム不安定性の他のタイプを検出する能力に依存する。しかし、アッセイデザインにおける創造性を調査するゲノム不安定性の多くの側面を可能にすることができる。例えば、URA3及びCAN1遺伝子は、結果に対するゲノム位置の任意の影響をテストするために異なるゲノムの部位に配置することができる。機能的遺伝子の対立遺伝子に特異的な非機能的遺伝子の対立遺伝子の復帰は、特定の突然変異のプロセスをテストすることができます。また、遺伝子または反復配列を有する遺伝子に隣接する複数の不活性な対立遺伝子の導入は、それぞれ、修復または遺伝子機能の喪失を介して組換え事象を調べるために使用することができる。変動試験は、これらのさまざまなゲノム不安定性事象9の速度を決定するための標準的なアプローチである。プロトコルは牟田を決定するために、十分に受け入れられ、比較的単純リー·コールソン中央値推定器を使用して書かれているション率はMSS-最尤推定法は突然変異率9を決定するための最善のアプローチと考えられているにもかかわらず、多様な研究者にとってよりアクセスしやすくします。 MSS-最尤推定量は、以前に詳細9に概説されており、代替方法として使用することができるが、より高度な計算を必要とする。代替的に、この方法で突然変異率を計算するためのフリーソフトウェア22は使用可能になった。突然変異率の再現性のある措置を得ることは、10,000倍以上で人口規模が大きくなるに十分低い初期細胞密度で培養物を接種すること、十分な反復培養の使用を含む実験計画のいくつかの側面、に注意を必要とし、全体のように、適切な培養容量を選択する細胞の集団は、選択培地上に塗布することができる。後者の点については、前述の式は、培養テスト=の割合に基づいて突然変異率を調整するために使用することができD 9。培養物の増殖速度の変化が再現可能な突然変異率の決定を複雑にすることができ、そのような状況では、より再現性のある結果を生じ得る修飾された中央値に基づく推定器は、最近23に記載されている。
正確細胞齢を測定する能力は、古い細胞におけるゲノム不安定周波数による若い細胞内イベントの発生率が期待値と異なるかどうかを確立するために重要であるもう一つの要因である。私たちは、WGA染色はWGAは、異なる蛍光分子にコンジュゲート利用可能であるので、両方の背景と柔軟性の観点から、白染色をカルコフロールすることが好ましいことを見出した。この柔軟性は、蛍光試薬と他の細胞の特性の同時測定のためのより多くの機会を提供することができる。 WGA染色および細胞上の蕾瘢痕対応する数のための信号強度との関係を確立するための最初の作業は、より多くをもたらすことができるフローサイトメトリーを介して細胞齢を迅速に決定。このアプローチは、典型的には、測定の再現性改良のために顕微鏡で検査されるより大きな集団サイズの使用を可能にする。すべての年代測定は、細胞の顕微鏡検査を通じて行うことができる一方で、私たちは、フローサイトメトリーのアプローチは年齢依存ゲノム不安定性に影響を与える要因の迅速なスクリーニングを容易にすると考えています。
確実にセル年齢を測定することに加えて、考慮事項は、母細胞が細胞を増殖および並べ替えの各連続ラウンドを受けることが許可されている細胞分裂の数を与えられる必要がある。小さい初期集団の大きさ以上の培養液量を使用すると、細胞が所望の細胞密度に到達する前に、より細胞分裂を受ける可能性があります。例えば、他の研究者は、より少ないexperime古い細胞を得る明白な利点を有する非常に古い酵母細胞16を得るために選別つだけのラウンドを使用しているNTALステップ。細胞がソーティングの前にそれ以上の細胞分裂を完了できるように培養液量を増やすかどうかを検討する際、念頭に置いて、単一の列で処理することができる細胞の総数に制限を続ける。より大きな培養容量の使用は、一つの細胞集団をソートする複数の列の使用を必要とすることができる。細胞は、ソート/収集ポイント間の細胞分裂の少ないラウンドを受ける場合も、その後寿命の間に異なる時点で予想される突然変異頻度からの偏差を観察するより多くの機会がある。例えば、製品寿命中のみで、早期のサンプリング及び後期の時点は、データの変異頻度が着実に増加を示したが、すぐに、その後プラトーその突然変異頻度が増加を示す可能性が寿命の間に追加の中間の時間でサンプリングを生成することができる。このプロトコルは古い母細胞を分離するので、年齢とともに突然変異率の変化のより直接的な測定値を得るための機会がある。変動試験は、bの可能性eは、突然変異率は、若い細胞を用いて得られた速度と異なるかどうかを決定するために、異なる年齢の母細胞を用いて行った。彼らが成長するにつれて、これらの変動試験のための培養は古く、若い細胞の混合物となりますが、若い細胞で出発して得率からの逸脱は、古い出発集団の使用に起因する可能性がある。
再現性よく正確にゲノム不安定性を測定するために、高齢者の母細胞の十分な大きさの集団を得る能力は、このアプローチの成功に不可欠です。プロトコルがこの目的のための特定の磁気ソーティングシステムの使用を説明しているが、他のグループは、代替システム14,18( 材料の表を参照)、酵母母細胞を選別している。製造業者のプロトコルのいくつかの最適化が必要になることができたにもかかわらずこのような代替システムはまた、この方法で動作するはずです。関係なく、使用される特定のシステムの、人口規模が必要ですdは研究のために選択突然変異またはゲノム再編成の種類の周波数によって異なる。最低でも、変異頻度を計算するために、人口あたり少なくとも1つの変異体コロニーを得るために十分な母細胞が存在しなければならない。唯一のゼロ5に対する変異コロニーは人口規模、人口規模の小さな増加から期待されている場合は、五から十突然変異体コロニーが期待されていることを、大幅に再現性を向上させることができますので、実際には、結果は、非常に可変することができます。ビオチン出発集団を標識する場合、各ソートのための回収効率は、古い母細胞における変異頻度を測定するために必要な適切な集団の大きさを特定するために考慮に入れる必要がある。各ソート後の母細胞の90%の回収率では、元の人口のわずか59%の成長と選別の5ラウンド後に回収されることになる。これは〜33%の成長率の5ラウンド後、元の人口の回復とラベルされた母細胞のわずか80%が回復している場合は、ソートに低下各ソート中に編。母集団の大きさの二から三倍の減少が簡単に人口あたりの突然変異体コロニーの信頼性の低い数字につながる可能性があるため、低周波イベントを測定する際の測定と回復を最大化することは非常に重要です。
上の拡張または有糸分裂細胞老化中にゲノム不安定性のより広い理解を得るために、このプロトコルを変更するための多数のオプションがあります。簡単な例としては、遺伝子機能、メディアの変更、またはその他の環境条件の変化の変化は年齢とともに変異の蓄積を変える方法を分析することを含む。改変された遺伝子機能又は適切な条件で若い細胞のための突然変異率を測定し、対照細胞集団に比べて異なった速度値により予測と比べて変異が異なって蓄積するかどうかを決定するために使用される。複製老化中の異なる点での細胞集団は、そのような活性酸素種またはDNA損傷剤のような特定のストレス要因にさらされる可能性があります。 A酸化ストレスに対する一過性の軽度の曝露は、実質的に細胞選別( 図3)を実行する機能には変わりはありませんでしたが、厳しいストレスは、細胞の回復を複雑にするかもしれない。予備実験は、母細胞はまだ特定のストレスの後に効率的に回収できることを確認することが必要であろう。さらに、単離された母細胞の細胞特性は、活性酸素種、ミトコンドリアおよび液胞形 態、及び3を老化と関連している他の生理学的特性のレベルを含む、詳細に分析することができた。また、母細胞は、さらなる処理または操作のための出発集団であってもよい。母と娘細胞が物理的手順の間に分離されているので、娘細胞は、依然として、分析のために用意されています。例えば、娘細胞または酵母母と娘細胞との間の損傷を受けた巨大分子の非対称継承の生理学的特性の変化<sアップ>図24は、変異頻度/レートのいずれかの興味深い変更のタイミングと比較することができた。娘細胞集団のための突然変異頻度はまた、複製老化の間の変異の非対称の継承があるかどうかをモデル化しようとするために得ることができた。要約すると、変動試験と磁気細胞ソーティングを通して母細胞の濃縮を組み合わせてSの利点を可能にする·セレビシエモデル系は、効率的に、有糸分裂細胞老化中の遺伝的変化の蓄積に関与するメカニズムを調査に適用される。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、この記事の内容は、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を反映するものではないPHMに国立衛生研究所の国立老化研究所からの助成金R00AG031911によって部分的にサポートされていました。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | 100mg |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | 2ml MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin antibodies (isotype: mouse IgG1) |
MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | 25 columns suitable for QuadroMACS separator |
QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Separator Only |
QuadroMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | Includes: QuadroMACS Separator (130-090-976), MACS MultiStand (130-042-303), LS Columns (130-042-401), MACS 15ml Tube Rack (130-091-052), One 2ml unit of MACS MicroBeads. Note: Alternative systems include Dynabeads Biotin Binder and MagnaBind Magnetic Beads |
BD Falcon Cell Strainer, 40 µm | BD Biosciences | 352340 | 40 µm for use with BD Falcon 50 ml Conical Tubes. 50 per pack |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | Powder, filtering after dissolving important to remove particulates |
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor488 | Life Technologies | W11261 | Conjugates with different excitation/emission spectra could also be used |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | 10 ml, other antifade reagents could also be used |