Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

Summary

Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l'aide d'un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée.

Abstract

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Introduction

Le calcium est un second messager important de responsable de la transmission de signaux physiopathologiques ¹ et physiologique cellulaire. Les concentrations de calcium cytosolique sont maintenus bas grâce à l'activité des pompes et des échangeurs de calcium de calcium. Le sarcoplasmique / endoplasmique ATPase du réticulum calcium (SERCA) remplit le réticulum endoplasmique (RE) magasin de calcium dans le cadre d'un système de «pompe de fuite" alors que le calcium ATPase de la membrane plasmique (PMCA) expulse calcium dans le compartiment extracellulaire, à la fois dans les mœurs dépendant de l'ATP ^2. Messagers physiologiques, telles que des hormones ou des neurotransmetteurs, transmettent leurs signaux à G récepteurs couplés aux protéines, l'activation de la phospholipase C, qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) dans la membrane plasmique à générer diacylglycérol et l'inositol triphosphate (IP3) ^3. Bien diacylglycérol reste dans la membrane plasmique, IP3 diffuse dans le cytosol et se lie à un récepteur d'IP3s (IP3Rs), qui sont activés ligand canaux calciques, qui se trouvent dans la membrane du RE et le calcium est libéré du magasin ER luminale a abouti à une augmentation de la concentration en calcium cytosolique ^4. Une autre voie pour le calcium pour atteindre le cytosol est à travers les canaux calciques et des échangeurs présents dans la membrane plasmique. Diaphonie entre ces deux compartiments ont été décrites: la libération de calcium de calcium induite (CICR) où le calcium extracellulaire induit la libération de calcium à partir de ER magasins ⁵ et magasin exploité entrée de calcium (SOCE) où la vidange des magasins à l'urgence est détectée par la STIM et provoque l'ouverture de Orai les canaux de calcium dans la membrane plasmique afin de promouvoir le remplissage des magasins ER ^6.

Dans des conditions physiopathologiques, la réponse calcique cellulaire est l'augmentation de calcium cytosolique déréglementés et en l'absence de stimulateurs physiologiques ^1. La réponse du calcium peut être affectée à un certain nombre de façons: calcium prolongésignal retardé élimination du calcium du cytosol, l'épuisement des réserves de calcium ou des changements localisés de calcium. En outre, les mitochondries ont un rôle central dans la mémoire tampon et la libération de calcium ^7. Prolongé et / ou supramaximal augmentation de calcium cytosolique entraîne la mort cellulaire. En fait, le calcium est le plus souvent impliqué dans la réponse physiopathologique cellulaire et est un événement clé dans un large éventail de maladies, comme les maladies neurodégénératives, les maladies cardiaques, le cancer, les maladies osseuses et les maladies du rein, qui sont principalement associée à la mort cellulaire et la perte ou l'altération des organes ou de tissus fonction ^8-10. En outre, la perturbation des signaux du calcium a été liée à l'adaptation cellulaire et des changements dans les fonctions cellulaires et des réponses.

Traditionnellement, les signaux calciques sont mesurés avec un indicateur de calcium fluorescent chargé négativement qui est chargé dans les cellules sous forme d'un ester d'acétoxyméthyle cellule perméable (AM). Une fois clivée par esteras cellulaireses, les indicateurs fluorescents restent dans le compartiment intracellulaire et augmentent l'intensité de fluorescence lorsque le calcium est lié. L'indicateur de calcium le plus connu et utilisé est le quotientométrique Fura-2 développé par Roger Tsien et ses collègues ^11. indicateurs de calcium ayant des affinités différentes pour le calcium permettent à différents pools de calcium à surveiller. Les méthodes de détection comprennent l'imagerie des cellules vivantes, fluorescence lecteur de microplaques et la cytométrie de flux. La cinétique relativement rapide de signaux calciques (généralement au bout de quelques secondes à quelques minutes) fait Imagerie de cellules vivantes la meilleure méthode pour gagner le plus d'informations sur les caractéristiques du signal de calcium. Mis à part la cinétique rapide de signaux calciques (quelques millisecondes), imagerie de cellules vivantes est une meilleure méthode pour étudier la compartimentation cellulaire de la signalisation calcique dans une seule cellule ^12. Les concentrations de calcium absolues peuvent être calculées par la détermination de la fluorescence minimale et maximale du calcium indicator par addition d'un chélateur de calcium et perméabilisation des cellules, respectivement, comme décrit par Grynkiewicz et al., ^11.

L'utilisation de la cytométrie en flux pour mesurer des signaux de calcium a été développé dans les années 1980 dans des cellules immunologiques où la possibilité de mesurer des paramètres tels que l'intégrité de la membrane et la séparation de la population de cellules, et l'exigence de cellules en suspension combinée avec le développement de la longueur d'onde unique indicateurs de calcium fait cytométrie de flux une méthode idéale et convenientdetection ^13-15. Dans les cellules adhérentes, imagerie des cellules vivantes fournit le plus d'informations sur la signalisation calcique, surtout la cinétique, mais nécessite une installation complexe comprenant un microscope à fluorescence, un système de perfusion, l'entretien de l'environnement cellulaire, telles que la température, et un logiciel de microscope spécialisé pour l'acquisition et l'analyse des données. Des méthodes alternatives comme un lecteur de microplaques à fluorescence ou pharmacolmoyens giques grâce à l'utilisation de chélateurs de calcium sont incomparables en termes d'information acquise. La cytométrie en flux est de plus en plus largement utilisés pour surveiller calcium cytosolique dans les cellules adhérentes si, dans la majorité des études, ne finissent point les mesures sont effectuées. En utilisant le procédé développé initialement par Gergely et al., Dans les cellules B immunologiques ^16, les variations de concentration de calcium libre cytosolique par cytométrie en flux avec une cinétique en temps réel et le contrôle de l'intensité de fluorescence dans des cellules individuelles à partir d'une population d'échantillon ont été mesurés avec succès dans des cellules épithéliales cancéreuses et les hybrides de cellules souches du cancer ^17. Cette méthode est en outre adapté pour une utilisation dans des cellules épithéliales adhérentes, qui sont difficiles à charger avec des indicateurs de calcium ^18.

Ici, en utilisant une lignée de cellules épithéliales immortalisées adhérente dérivée du segment S1 du rein de rat tubule proximal (CL.2 WKPT-0293) ^19, nous décrivons un m simplifié optimisééthode pour la mesure de l'évolution de la concentration en calcium cytosolique par cytométrie de flux. Depuis de nombreuses cellules épithéliales possèdent un certain nombre de transporteurs organiques pour les composés anioniques, le chargement des cellules avec un indicateur de calcium peut se révéler être un défi. Pour éviter que l'efflux de calcium, les indicateurs de probénécide, l'inhibiteur prototype de transporteurs d'anions organiques et développé à l'origine pour diminuer l'excrétion rénale de la pénicilline ^20, est appliquée simultanément dans le milieu d'incubation. Les cellules sont maintenues dans des monocouches de chargement indicateur de calcium, mis en suspension et des signaux de calcium peuvent être détectés immédiatement après l'addition du composé.

Protocol

1. Préparation des réactifs et des solutions Préparer une solution de Hank équilibrée en sel modifié (HBSS) (en mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, sans rouge de phénol). Conserver à 4 ° C. Ajouter 1,5 M de CaCl2 2 M et l'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7,2) des solutions de réserve avec de l'eau distillée. Préparer une solutio…

Representative Results

Pour augmenter le calcium cytosolique, deux composés pharmacologiques ont été appliquées aux cellules des tubules rénaux proximaux (WKPT-0293 CL.2) chargés de colorant de liaison cellulaire calcium perméable, Fluo-3-AM. Les échantillons de contrôle non traités ont été chargées avec un colorant de liaison de calcium en présence de probénécide et ont été mélangés mais sans l'addition de tous les composés. Thapsigargine (TG) est un inhibiteur classique de la pompe de SERCA conduisant à une fuite h…

Discussion

Le calcium est un événement clé dans de nombreux processus cellulaires qui agissent comme une seconde molécule de signalisation de messager et également en tant que moyen pour la communication entre le RE et les mitochondries. La capacité de mesurer l'évolution des concentrations libres de calcium cytosolique est une technique utile qui peut appliquer à tous les domaines de la biologie cellulaire. Il existe différentes méthodes pour détecter les signaux de calcium cytosolique. Classiquement, des signaux d…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	Cell permeable
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line			Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)