दिशानिर्देश कोशिकाओं पेश हत्यारा कृत्रिम प्रतिजन की पीढ़ी के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं, KaAPC, मानव प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की इन विट्रो कमी और एक antigen- में टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग के उपचार के लिए सेलुलर प्रतिरक्षा करने के लिए एक वैकल्पिक समाधान के लिए एक कुशल उपकरण शेष प्रतिरक्षा प्रणाली समझौता किए बिना विशिष्ट फैशन.
टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग की वर्तमान उपचार इस तरह के संक्रमण या कैंसर नियंत्रित करने के लिए एक कम क्षमता के रूप में लंबे समय में, प्रतिकूल दुष्प्रभावों के साथ है, जो वैश्विक प्रतिरक्षादमन, की रणनीतियों पर ज्यादातर निर्भर करता है. इसलिए, नए तरीकों को ही रोग मध्यस्थता कोशिकाओं को लक्षित और बरकरार शेष प्रतिरक्षा प्रणाली छोड़ कि विकसित किए जाने की जरूरत है. पिछले दशक के दौरान सेल आधारित immunotherapy रणनीतियों की एक किस्म टी सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विकसित किया गया है मिलाना. इन तरीकों में से अधिकांश सहिष्णुता उत्प्रेरण प्रतिजन पेश कोशिकाओं (एपीसी) पर भरोसा करते हैं. हालांकि, तकनीकी रूप से कठिन और बोझिल होने के अलावा, इस तरह के सेल आधारित दृष्टिकोण उनके चिकित्सीय क्षमता की सीमा जो साइटोटोक्सिक टी सेल प्रतिक्रिया, के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं. यहाँ हम फिर से जाते वक्त वैकृत टी कोशिकाओं की कमी के लिए अनुमति देता है जो गैर सेलुलर हत्यारा कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश की पीढ़ी (KaAPC), के लिए एक प्रोटोकॉल पेशmaining प्रतिरक्षा प्रणाली अछूता और कार्यात्मक. KaAPC एक विशिष्ट प्रतिजन फैशन में अवांछनीय टी सेल प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने से autoimmune रोग और allograft rejections के इलाज के लिए क्षमता है जो सेलुलर प्रतिरक्षा करने के लिए एक वैकल्पिक समाधान है.
पिछले दो दशकों में बहुत प्रगति autoimmune रोग का रोगजनक तंत्र को समझने में किया गया है. हालांकि, सबसे आम उपचार अभी भी corticosteroids के साथ ही ऐसे purine analogs रूप immunosuppressive दवाओं, क्षारीकरण एजेंटों और calcineurin inhibitors 1 पर भरोसा करते हैं. ऐसी दवाओं का उपयोग बहुत रोगियों के रोग का निदान में सुधार हुआ है, अभी तक उपचार अंतर्निहित प्रतिरक्षाविज्ञानी खराबी के इलाज प्रदान नहीं करता है. इसके अलावा, रोगियों के संक्रमण के लिए और कैंसर के विकास के लिए असुरक्षित हो गया है.
इसलिए टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग और allograft अस्वीकृति के उपचार के लिए अंतिम लक्ष्य विशेष रूप से, एक ही समय में, अछूता और प्रतिरक्षा विकारों से लड़ने के लिए सक्षम शेष प्रतिरक्षा प्रणाली को छोड़ने जबकि टी कोशिकाओं के कारण ही बीमारी को लक्षित करने के लिए है. उपयोग प्रतिजन पेश कोशिकाओं (एपीसी) परिधीय टी सेल प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए एक इलाज के रूप में पहले के रूप में जल्दी के रूप में वर्णित किया गयाकई समूहों द्वारा 1970 के दशक. तो कई सेल आधारित दृष्टिकोण विकसित किया गया है के बाद से (SCHUTZ एट अल. 2 में समीक्षा). Immunoregulatory कोशिकाओं स्वरोगक्षमता, allograft अस्वीकृति और पुराने संक्रमण के उपचार के लिए चिकित्सीय क्षमता का संकेत आशाजनक परिणाम से पता चला है के रूप में FasL व्यक्त हत्यारा एपीसी का उपयोग रणनीतियाँ. हालांकि, अंत में उनके नैदानिक प्रयोज्यता सीमित है कि FasL हत्यारा एपीसी उपयोग रणनीतियों के साथ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं; कृषि मूल्य आयोग (i) पीढ़ी या अलगाव समय, श्रम और गहन लागत है (द्वितीय) cytopenia से कारण प्रतिरक्षादमन को पीड़ित रोगियों सीमित मात्रा में और कोशिकाओं की गुणवत्ता प्रदान (iii) ऐसे अत्यधिक में FasL परिणाम के रूप में apoptosis उत्प्रेरण संकेतों के साथ कोटिंग या एपीसी का पारगमन चर phenotypes और (iv) हत्यारा एपीसी फलस्वरूप उनके चिकित्सीय क्षमता को कम टी कोशिकाओं की प्रेरक कार्यों साइटोटोक्सिक के प्रति संवेदनशील हैं. इसलिए, यह एक परिभाषित प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हत्यारा एपीसी pheno की गारंटी करने के लिए मुश्किल हैविवो में टी सेल प्रतिक्रिया के प्रतिजन विशेष मॉडुलन के लिए उपयोग किया जा सकता है कि प्रकार.
हत्यारा एपीसी 3-5 और कृत्रिम प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPC) व्यक्त FasL साथ हमारे पिछले काम के आधार पर 6,7 हम ऑटो प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के प्रतिजन विशेष निषेध या उन्मूलन में के लिए एक मनका आधारित दृष्टिकोण (KaAPC) विकसित इन विट्रो. KaAPC एक एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक डिमर (संकेत 1) और covalently 4.5 माइक्रोन अणुचुंबकीय लेटेक्स मनका की सतह पर स्थिर एक विरोधी फैस मैब (apoptosis उत्प्रेरण संकेत) से मिलकर बनता है. वे एक प्रतिजन विशेष ढंग से कई specificities के टी सेल संस्कृतियों से एक फैस / FasL मध्यस्थता फैशन में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं गिरेगा और सक्रियण प्रेरित कोशिका मृत्यु (AICD) मार्ग से स्वतंत्र. लक्षित टी कोशिकाओं में खुराक निर्भर apoptosis पहले से ही 30 मिनट 8 के बाद तेजी से प्रेरित है.
KaAPC आसानी से एक नियंत्रित फैशन में उत्पन्न किया जा सकता है एक शेल्फ phenot बंद परिभाषित सुनिश्चितype और सेल आधारित कमी रणनीतियों की कमियों का सबसे उबरने. नतीजतन, KaAPC टी सेल विशिष्ट उपचार रणनीतियों के क्षेत्र में आगे बढ़ने, टी सेल की मध्यस्थता autoimmune रोग और allograft अस्वीकृति के उपचार के लिए महान क्षमता प्रदर्शित करते हैं.
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम संकेत 1 (पेप्टाइड MHC) और संकेत 2 (एंटी फैस एमएबी) के उचित अनुपात सुनिश्चित करने के लिए है. हम संकेत 1 और 2 के लिए एकदम सही अनुपात को परिभाषित करने के लिए गहन अनुमापन प्रयोगों प्रदर्शन किया है; यह कारण एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक डिमर या विरोधी फैस मैब सांद्रता में मतभेदों को कम से कम विविधताओं KaAPC की कार्यक्षमता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि स्पष्ट हो गया. इस प्रकार, दोनों संकेतों की एकाग्रता हमेशा सत्यापित किया जाना चाहिए और दोनों प्रोटीन की गुणवत्ता में अक्सर यह एक वाणिज्यिक स्रोत से आदेश दिया गया था, भले ही परीक्षण किया जाना चाहिए. अलग पहचान assays के विभिन्न सांद्रता में परिणाम हो सकता है के रूप में इसके अलावा, सांद्रता हमेशा एक ही परख द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. एचएलए-A2 पुलिस महानिरीक्षक की कार्यक्षमता भी कारण अधूरा refolding और / या अक्षम पेप्टाइड लोडिंग को प्रभावित किया जा सकता है. इसके अलावा डिमर अणुओं प्रोटीन की कार्यात्मक गतिविधि पर प्रभाव पड़ सकता है, जो विभिन्न डिग्री, के लिए कुल कर सकते हैं. इसलिए, actuडिमर के अल राशि भिन्न हो सकते हैं एक कार्यात्मक और विशिष्ट KaAPC की पीढ़ी के लिए की जरूरत है. इसके अलावा, हम KaAPC पर संकेत विरोधी फैस मैब उत्प्रेरण मौत के लिए आदर्श रेंज बेहद तंग है कि पाया. हमारे हाथ मात्रा में अधिक से अधिक 3.64 माइक्रोग्राम / एमएल नीचे मात्रा एक खुराक पर निर्भर करता है कम हत्या गतिविधि में हुई जबकि मिलीलीटर फैस सकारात्मक टी कोशिकाओं की गैर विशिष्ट हत्या करने के लिए नेतृत्व / 3.64 माइक्रोग्राम. इन स्थितियों में काफी तंग लगता है, इन विवरण के लिए ध्यान एक कार्यात्मक और विशिष्ट KaAPC की पीढ़ी में परिणाम होगा.
वर्तमान KaAPC फेनोटाइप भोले या आराम प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को लक्षित सक्रिय प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं, प्रारंभिक प्रयोगों की कमी के लिए कार्यात्मक है जबकि इन आबादियों फैस अभिव्यक्ति कम कर दिया है के रूप में विशिष्ट प्रतिजन apoptosis की कोई महत्वपूर्ण प्रेरण का प्रदर्शन किया. इसलिए, उन्हें एक बारी बनाने के लिए टी कोशिकाओं आराम पर फैस के ऊपर विनियमन के लिए प्रेरित करने के लिए KaAPC पर एक सह उत्तेजक संकेत जोड़ने कल्पना कर सकते हैंKaAPC के लिए एक लक्ष्य में. यह संभव है जबकि सभी तीन संकेतों सावधानी से एक कार्यात्मक KaAPC फेनोटाइप सुनिश्चित करने के लिए titrated करना होगा.
एक biocompatible या biodegradable मैट्रिक्स के लिए मनका मंच समायोजन विवो प्रयोज्यता में KaAPC में वृद्धि होगी. हाल ही में, शेन एट अल. KaAPC -TRP2 11 बी विरोधी फैस (क्लोन Jo2) और विरोधी उनकी / एच 2 कश्मीर संयुग्मित 5 माइक्रोन लेटेक्स मोती के उपयोग के विवो उपयोग करने में सफल सूचना दी है. हम कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश (aAPC) की सामान्य अवधारणा को सफलतापूर्वक एनएम आकार के कणों से 12 आकार माइक्रोन से स्थानांतरित किया जा सकता है और कार्यक्षमता है कि कण ज्यामिति 13 से प्रभावित है कि दिखाने के लिए सक्षम किया गया है. इस प्रकार, आकार और / या भविष्य KaAPC का आकार अलग से एक अंग विशिष्ट autoimmune रोग का सफल उपचार के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है जो इन विवो कार्यक्षमता और जैव वितरण, पर असर करने में सक्षम हो सकता है डिजाइन.
<p cलड़की = "jove_content"> KaAPC दाता हालत और पूर्व उपचार के स्वतंत्र है कि, समय और लागत प्रभावी दृष्टिकोण "शेल्फ" का उपयोग करने के लिए एक आसान के रूप में सेल आधारित कमी रणनीतियों की प्रमुख कमियों को दूर. KaAPC स्वयं या पैराक्राइन हत्या संकेतन का लक्ष्य और सीटीएल के cytolytic प्रेरक कार्यों के प्रति संवेदनशील नहीं हैं. KaAPC प्रासंगिक रोग प्रतिजन की पहचान की आवश्यकता होती है और उनके विशिष्ट एचएलए प्रकार पर निर्भर करेगा. टाइप 1 मधुमेह के लिए वर्तमान में कई उपयुक्त एचएलए-A2 प्रतिबंधित एंटीजन जबकि, GvHD और गुणकों काठिन्य 2, मैं आगे बढ़ाने के लिए और की प्रयोज्यता व्यापक होगा अणुओं के साथ ही नए autoimmune प्रासंगिक एंटीजन के चल रहे पहचान डिमर अतिरिक्त एचएलए वर्ग के विकास की पहचान की गई है KaAPC. इसके अलावा एक साथ कई एंटीजन को लक्षित करने के लिए विभिन्न epitopes पर निर्देशित KaAPC का उपयोग कर के बारे में सोच सकता है.संक्षेप में, KaAPC एक के लिए एक लचीला मंच प्रौद्योगिकी का प्रतिनिधित्वtigen विशेष टी सेल रिक्तीकरण. उनके "लेगो की तरह" प्रकृति ऐसी व्यापक और इन विट्रो में और vivo प्रयोज्यता में उनके बाद में वृद्धि कर सकता है जो विभिन्न matrices पर ऐसे PD1 या निशान के रूप में अतिरिक्त सह उत्तेजक या निरोधात्मक संकेत के रूप में नए संकेतों के शामिल किए जाने के लिए सक्षम बनाता है. हम साथ साथ KaAPC, अलग specificities के टी सेल के मिश्रण से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए पहला मनका आधारित दृष्टिकोण उत्पन्न करने के लिए कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
चित्रा 3 KaAPC एक प्रतिजन विशेष फैशन में सीटीएल को समाप्त एक 1 के लिए फैस + प्रेरक स्मृति सीटीएल सक्रिय PKH26 लेबल और मिश्रित थे वही दाता से CMVpp65 विशेष सीटीएल PKH67 लेबल:. CMVpp65 KaAPC साथ 1 अनुपात और सह सुसंस्कृत 48 घंटे के लिए. नियंत्रण संस्कृतियों उतार KaAPC, या 1 ग्राम / एमएल के साथ इलाज किया गयाके घुलनशील विरोधी फैस मैब (क्लोन CH11). व्यवहार्य कोशिकाओं का कम से कम नुकसान अनुपचारित मिश्रित सीटीएल संस्कृतियों (टी मिक्स) में निर्धारित किया गया था. टी मिश्रण के प्रत्येक सीटीएल आबादी के लिए मूल FACS डेटा दिखाए जाते हैं. पहले दोनों टी सेल आबादी 10 पर अलग gating द्वारा प्रकाशित के रूप में apoptosis के विश्लेषण किया गया था. ऊपरी बाएँ quadrants में दर्शाया संख्या कुल कोशिकाओं की% का प्रतिनिधित्व करता है. illustrating आंकड़ा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के बाहर एक प्रतिनिधि प्रयोग से प्राप्त होता है. इस शोध मूल रूप से रक्त में प्रकाशित किया गया था. . SCHUTZ, सी एट अल खूनी कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं पेश: एक उपन्यास रणनीति विशेष टी कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए रक्त.. 2008; 111, 3546-52. कॉपीराइट रुधिर के अमेरिकन सोसायटी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
The authors have nothing to disclose.
यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (सीएस) और KFO 146 (एमएफ) द्वारा समर्थित किया गया है, रक्षा अनुदान पीसी की डीओडी विभाग 040972 (एमओ) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान RO1 CA108835 अनुदान , RO1 Ai44129 (JPS)
Name | Company | Cat # | Comments |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
Cryo-tube 2ml | Corning | 430488 | |
anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
sodium chloride | Merck | S271-3 | |
calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
96well round bottom plate | Falcon | 353077 | |
AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
FACS tubes | Falcon | 352008 |