Retningslinjer præsenteres til generering af killer kunstige antigenpræsenterende celler, KaAPC, et effektivt værktøj til in vitro-udtømning af humane antigen-specifikke T-celler, og en alternativ løsning til cellulær immunterapi til behandling af T-celle-medierede autoimmune sygdomme i et antigen specifik måde uden at kompromittere den resterende immunsystemet.
Nuværende behandling af T-celle-medierede autoimmune sygdomme meste afhængig strategier for global immunosuppression, hvilket på lang sigt, er ledsaget af bivirkninger, såsom en nedsat evne til at bekæmpe infektioner eller maligne sygdomme. Derfor er det nødvendigt, nye tilgange, der skal udvikles, der kun målretter mod sygdom medierende celler og lade det resterende immunsystem intakt. Over det seneste årti en række cellebaserede immunterapi strategier til at modulere T-celle-medierede immunresponser er blevet udviklet. De fleste af disse metoder er afhængige af tolerance-fremkaldende antigen-præsenterende celler (APC). Men foruden at være teknisk vanskelig og besværlig, er meget følsomme over for cytotoksiske T-celle-responser, hvilket begrænser deres terapeutiske kapacitet sådanne cellebaserede. Her præsenterer vi en protokol til generering af ikke-cellulær killer kunstige antigenpræsenterende celler (KaAPC), som giver mulighed for udtømning af patologiske T-celler mens reresterende immunsystem uberørt og funktionelle. KaAPC er en alternativ løsning til cellulær immunterapi, som har potentiale til behandling af autoimmune sygdomme og allotransplantatafstødninger ved at regulere uønskede T-celle responser på en antigenspecifik måde.
I løbet af de sidste to årtier er der gjort store fremskridt i forståelsen af patogene mekanismer i autoimmune sygdomme. Men det mest almindelige behandlinger stadig kunne stole på kortikosteroider samt immunosuppressive lægemidler, såsom purinanaloger, alkyleringsmidler og calcineurinhæmmere 1. Anvendelsen af sådanne lægemidler har forbedret prognose for patienter, men behandlingen giver ikke en helbredelse af den underliggende immunologiske funktionsfejl. Endvidere patienter bliver sårbar over for infektioner og til udvikling af cancer.
Derfor det ultimative mål for behandling af T-celle medierede autoimmune sygdomme og allotransplantatafstødning er specifikt rettet mod kun sygdom, der forårsager T-celler, mens på samme tid, hvilket efterlader de resterende immunsystemet uberørt og kompetente til at bekæmpe immunologiske lidelser. Utilizing antigenpræsenterende celler (APC), som en behandling for at undertrykke perifere T-celle-responser blev først beskrevet så tidligt som1970'erne af flere grupper. Siden er blevet udviklet så mange cellebaserede midler (revideret i Schütz m.fl.. 2). Strategier via FasL-udtrykkende killer-APC som immunregulatoriske celler viste lovende resultater indikerer terapeutisk potentiale til behandling af autoimmunitet, allograftafstødning og kroniske infektioner. Men der er væsentlige begrænsninger med strategier udnytter FasL Killer-APC, som i sidste ende begrænset deres kliniske anvendelighed; (I) produktion eller isolation af APC er tid, arbejdskraft og omkostningskrævende (ii) at patienter, der lider af cytopeni grund immunosuppression levere begrænsede mængder og kvalitet af celler (iii) belægning eller transduktion af APC med apoptoseinducerende signaler såsom FasL resulterer i meget variable fænotyper og (iv) Killer-APC er følsomme over for cytotoksisk effektorfunktioner af T-celler følgelig reducerer deres terapeutiske potentiale. Derfor er det vanskeligt at sikre en defineret reproducerbar Killer-APC phenotype, der kan udnyttes til antigenspecifik modulering af T-celle responser in vivo.
Baseret på vores tidligere arbejde med FasL udtrykker Killer-APC 3-5 og kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC) 6,7 udviklede vi en perle tilgang (KaAPC) for antigen-specifik hæmning eller fjernelse af auto-reaktive T-celler i vitro. KaAPC består af en HLA-A2-Ig-dimer (signal 1) og et anti-Fas-mAb (apoptoseinducerende signal) kovalent immobiliseret på en overflade af en 4,5 um paramagnetisk latexperle. De nedbryder antigenspecifikke T-celler i et Fas / Fas-L-medierede mode fra T-cellekulturer af multiple specificiteter på en antigen-specifik måde og uafhængigt af aktivering induceret celledød (AICD) vej. Dosisafhængig apoptose i målrettede T-celler induceres hurtigt allerede efter 30 min 8.
KaAPC kan let genereres i en kontrolleret måde sikrer en defineret fra hylden phenotype og overvinde de fleste af manglerne ved cellebaserede udtynding strategier. Følgelig KaAPC vist stort potentiale til behandling af T-celle medierede autoimmune sygdomme og afstødning, fremme inden for T-celle specifikke behandlingsstrategier.
Det mest kritiske trin i protokollen er at sikre passende forhold mellem signal 1 (peptid MHC) og signal 2 (anti-Fas-mAb). Vi har foretaget intensive titreringsforsøg for at definere det perfekte forhold for signal 1 og 2; det blev klart, at minimale variationer, som skyldes forskelle i HLA-A2 Ig-dimer eller anti-Fas mAb-koncentrationer kan forstyrre funktionaliteten af KaAPC. Derfor bør koncentrationen af begge signaler altid kontrolleres og kvaliteten af begge proteiner bør jævnligt testes, selvom det blev bestilt fra en kommerciel kilde. Endvidere bør koncentrationen altid bestemmes af det samme assay som forskellige påvisningsassays kan resultere i forskellige koncentrationer. Funktionalitet af HLA-A2-Ig kan også blive forringet på grund af ufuldstændig refoldningen og / eller ineffektiv peptid belastning. Desuden dimer molekyler kan samle til forskellige grader, hvilket kan få konsekvenser på den funktionelle aktivitet af proteinet. Derfor actual mængde dimer nødvendig til generering af et funktionelt og specifik KaAPC kan variere. Desuden fandt vi, at den ideelle område for døden inducere signal anti-Fas-mAb på KaAPC er ekstremt stramt. I vore hænder større mængder 3.64 ug / ml føre til ikke-specifik drab på Fas positive T-celler, mens beløb under 3,64 ug / ml resulterede i en dosisafhængig reduceret drab aktivitet. Mens disse betingelser synes ganske stramt vil opmærksomhed på disse detaljer resultere i dannelsen af et funktionelt og specifik KaAPC.
Mens den aktuelle KaAPC fænotype er funktionel til udtømning af aktiverede antigenspecifikke T-celler, indledende forsøg rettet naive eller hvilende antigenspecifikke T-celler viste ingen signifikant induktion af antigen-specifik apoptose disse populationer har reduceret Fas-ekspression. Derfor kan man forestille sig tilsætning af et co-stimulatorisk signal på KaAPC at inducere opregulering af Fas på hvilende T-celler til at vende demind i et mål for KaAPC. Mens det er muligt alle tre signaler skal titreres forsigtigt for at sikre en funktionel KaAPC fænotype.
Justering perlen platform til en biokompatibel eller bionedbrydelig matrix forbedre KaAPC in vivo anvendelighed. For nylig, Shen et al. Har rapporteret den vellykkede in vivo-anvendelse af KaAPC udnytte 5 um latexperler konjugeret til anti-Fas (klon Jo2) og anti-His / H2-Kb -TRP2 11. Vi har været i stand til at vise, at det generelle koncept af kunstige antigenpræsenterende celler (AAPC) kan med held overføres fra um dimensioneret til nm mellemstore partikler 12 og at funktionaliteten påvirkes af partikelgeometri 13. Således ved at variere størrelsen og / eller form af fremtidig KaAPC designs man kunne være i stand til at have indflydelse på in vivo funktionalitet og bio-distribution, som kan være afgørende for en vellykket behandling af organspecifikke autoimmune sygdomme.
<p class = "jove_content"> KaAPC overvinde de store mangler i cellebaserede udtynding strategier som en nem at bruge "hyldevare", tid og omkostningseffektiv tilgang, der er uafhængig af donor tilstand og forbehandling. KaAPC er ikke mål for selvregulering eller parakrin drab signalering og ikke følsom over for cytolytiske effektorfunktioner af CTL. KaAPC vil kræve identifikation af den pågældende sygdom antigen og stole på deres specifikke HLA-type. Mens øjeblikket adskillige egnede HLA-A2 begrænsede antigener til type 1-diabetes, har GvHD og multipla sklerose blevet identificeret 2, udvikling af yderligere HLA klasse I dimer molekyler samt den løbende identifikation af nye autoimmune relevante antigener vil stige yderligere og udvide anvendeligheden af KaAPC. Desuden kunne man tænke på at bruge KaAPC rettet mod forskellige epitoper til at målrette flere antigener samtidigt.Sammenfattende KaAPC repræsenterer en fleksibel platform teknologi til entigen-specifikke T-celle-depletering. Deres "lego-lignende" karakter gør det muligt at medtage nye signaler såsom ekstra co-stimulerende eller hæmmende signaler såsom PD1 eller spor på forskellige matricer, der kan udvide og forbedre deres efterfølgende in vitro og in vivo anvendelighed. Vi heri præsentere trin-for-trin-protokollen til at generere KaAPC, den første perle tilgang til fjernelse af antigen-specifikke T-celler fra T-celle-blandinger med forskellige specificiteter.
Figur 3. KaAPC fjerne CTL på en antigen-specifik måde PKH26-mærkede aktiverede Fas + effektor-hukommelses-CTL og PKH67-mærket CMVpp65 CTL fra samme donor blev blandet til en 1:. 1-forhold og co-dyrket med CMVpp65 KaAPC i 48 timer. Kontrolkulturer blev behandlet med losset KaAPC eller 1 ug / mlaf opløseligt anti-Fas-mAb (klon CH11). Minimalt tab af levedygtige celler blev bestemt i ubehandlet blandet CTL kulturer (t mix). Originale FACS data for hver CTL population af T-mix er vist. Analyse af apoptose blev udført som tidligere offentliggjort af særskilt gating på begge T-cellepopulationer 10. Tal vist i øverste venstre kvadranter repræsenterer% af totale celler. Den illustrerer figur er afledt fra et repræsentativt eksperiment ud af tre uafhængige eksperimenter. Denne forskning blev oprindeligt udgivet i blod. . Schütz, C. m.fl. Killer kunstige antigenpræsenterende celler: en ny strategi til at slette specifikke T-celler Blood.. 2008 111, 3546-52. Ophavsret American Society of Hematology. Klik her for at se en større version af dette tal.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er blevet støttet af den tyske Research Foundation (DFG) SCHU 2681 / 1-1 (CS) og KFO 146 (MF), DOD forsvarsministerium tilskud PC 040.972 (MO) og National Institute of Health giver RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)
Name | Company | Cat # | Comments |
PBS | Corning | 21-040-CV | |
human AB serum | Atlanta biologicals | S40110 | |
EDTA | Sigma/Aldrich | E5134 | |
sodium azide | Sigma/Aldrich | 71289 | |
M-450 epoxybeads | Invitrogen/Dynal | 14011 | |
MPC-1 magnet | Invitrogen/Dynal | 12001D | |
screw top glass vial | Fisher Scientific | 03-338AA | |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
anti-CD95 (clone CH11) | Milliore | 05-201 | |
HLA-A2-Ig dimer | BD/Pharmingen | 551263 | |
Cryo-tube 2ml | Corning | 430488 | |
anti-mouse IgG1 PE | BD/Pharmingen | 559320 | |
anti-mouse IgM FITC | BD/Pharmingen | 553408 | |
sodium chloride | Merck | S271-3 | |
calcium chloride | Sigma/Aldrich | C5080 | |
HEPES | cellgro/Mediatech | 25-060-CI | |
RPMI | gibco/life technologies | 11875-085 | |
96well round bottom plate | Falcon | 353077 | |
AnnexinV FITC | PromoKine | PK-CA577-1001-1000 | |
7-AAD | BD/Pharmingen | 51-68981E | |
FACS tubes | Falcon | 352008 |