Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular<em> In Vitro</em

Summary

Este protocolo describe el uso de palancas de silicio microescala como superficies de cultivo flexibles para la medición de la contractilidad de las células musculares in vitro. La contracción celular hace que la flexión en voladizo, que se puede medir, grabada, y se convierte en lecturas de fuerza, proporcionando un sistema no invasivo y escalable para la medición de la función contráctil in vitro.

Abstract

El desarrollo de ensayos in vitro más predictivos y biológicamente relevantes se basa en el avance de los sistemas de cultivo de células versátiles que facilitan la evaluación funcional de las células sembradas. Para ello, la tecnología voladizo microescala ofrece una plataforma con la que para medir la funcionalidad contráctil de una gama de tipos celulares, incluyendo esquelético, cardiaco, y las células de músculo liso, a través de la evaluación de la contracción inducida por sustrato flexión. Aplicación de las matrices multiplexadas en voladizo proporciona los medios para desarrollar protocolos de moderado a alto rendimiento para la evaluación de la eficacia del fármaco y la toxicidad, fenotipo de la enfermedad y la progresión, así como neuromusculares y otras interacciones célula-célula. Este manuscrito proporciona los detalles para la fabricación de matrices voladizo fiables para este fin, y los métodos necesarios para con éxito células de cultivo en estas superficies. Una descripción más detallada se proporciona en los pasos necesarios para realizar anal funcionalanalysis de tipos de células contráctiles mantuvo en tales matrices usando una novela láser y sistema de foto-detector. Los datos representativos proporcionados destaca la precisión y la naturaleza reproducible de análisis de la función contráctil posible utilizar este sistema, así como la amplia gama de estudios a los que tal tecnología se puede aplicar. Amplia adopción exitosa de este sistema podría proporcionar a los investigadores con los medios para llevar a cabo estudios funcionales rápidas y de bajo costo in vitro, lo que lleva a predicciones más exactas de rendimiento de tejidos, desarrollo de la enfermedad y la respuesta al nuevo tratamiento terapéutico.

Introduction

The in vitro culture of muscle cells from both human and rodent sources has been possible for decades^1,2. However, while standard coverslip preparations are useful for biochemical assessment, they do not facilitate analysis of the cell’s primary functional output (contractility), and therefore are of somewhat limited value as a means to assess cellular maturation and performance. In order to maximize the amount of data obtainable from such in vitro cultures, it is necessary to advance the development of systems capable of housing such cells in configurations that permit the real-time assessment of their functional performance. The establishment of a multitude of three dimensional muscle models has made some progress toward fulfilling this need, and such systems have been used in a number of publications as a means to assess the contractile capacity of cultured muscle cells in vitro^3-5. While such systems are invaluable for tissue modeling and reconstruction studies, they are limited in their applicability for studies of single cell responses. In such cases where single fiber studies are necessary, complex and labor intensive ex vivo methodologies remain the only option^6-10. Furthermore, current movement toward the development of complex, multi-organ platforms for drug development and screening protocols requires the establishment of systems which are non-invasive, easily scalable and which integrate readily with supporting cells and tissue models¹¹.

Microscale cantilevers offer a simple method for assessing the functional contractile capacity of single cells/small populations of cells^12,13. The technique is based on modified Atomic Force Microscopy (AFM) technology¹⁴, and uses a laser and photo-detector system to measure microscale cantilever deflection in response to cultured myotube contractile activity. Modified Stoney’s equations are then used to calculate stress in the myotube, and the force exerted by the myotube in order to generate the observed substrate deflection¹⁵. A scanning program has been written which enables simultaneous assessment of multiplexed cantilever arrays, offering potential moderate to high through-put applications for drug toxicity/efficacy studies^15,16. Such technology may prove invaluable in the development of functional, pre-clinical assays for predicting drug efficacy in vivo. Furthermore, fabrication of cantilever chips in silicon does not impede post analysis processing of cells for standard biomolecular assays such as immunostaining, western blotting and PCR.

This manuscript provides detailed instructions on the fabrication and preparation of microscale silicon cantilevers, the hardware and software set-up, and the operating guidelines for assessing the functionality of contractile cells cultured on these chips. Standard cell culture techniques can be implemented for plating and maintenance of cells on these surfaces, hence any contractile cell type for which reliable culture parameters exist should be able to integrate with this device with ease. The relatively simple 2D culture parameters utilized in this system makes integration of other cell models or addition of cell types that can interact with muscle (such as innervating neurons) straight-forward, greatly increasing the applicability of this model in the development of more complex functional in vitro assays and multi-organ models of mammalian systems.

Protocol

1. Cantilever viruta Fabrication Detalles ilustrados de los pasos de fabricación descritos se proporcionan en la Figura 1. Coloque las obleas de silicio sobre aislante (SOI) en un horno y hornear a 125 ° C durante 20 minutos para deshidratar ellos. Depositar una gruesa capa de óxido de silicio 1,5 m sobre la capa de mango de la oblea SOI deshidratado usando un Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) de la herramienta. Coloque las t…

Representative Results

Cultivo con éxito de células contráctiles en voladizos es un procedimiento relativamente sencillo, utilizando técnicas estándar de cultivo de células (Figura 5). El porcentaje de los voladizos soportan células contratantes variará dependiendo del tipo de célula que se examina y técnica de cultivo específica empleada. El uso de células embrionarias de rata primarios derivados de las extremidades posteriores, la actividad contráctil se detectó el 12% de los voladizos examinadas (n = 4). Aná…

Discussion

Los pasos críticos en el análisis de voladizos microescala para la evidencia de la contracción celular son la colocación del chip en voladizo dentro de la platina del microscopio, y la posterior alineación del láser y foto-detector con la punta de los voladizos de las esquinas de la matriz. Si esto no se realiza con precisión, entonces el software no será capaz de extrapolar las posiciones de los voladizos restantes en la matriz, que puede conducir a la acumulación de falsos negativos durante la recogida de dat…

Materials

Name of material/ equipment	Company	Catalog number	Comments/ Description
Primary rat muscle growth medium
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	N/A
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
Glutamax (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRG400B	20 ng/ ml
Brain-Derived Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRB600B	20 ng/ ml
Ciliary Neurotrophic Factor	Cell sciences	CRC400A	40 ng/ ml
Neurotrophin-3	Cell sciences	CRN500B	20 ng/ ml
Neurotrophin-4	Cell sciences	CRN501B	20 ng/ ml
Acidic Fibroblast Growth Factor	Life Technologies	13241-013	25 ng/ ml
Vascular Endothelial Growth Factor	Life Technologies	P2654	20 ng/ ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ ml
Heparin Sulphate	Sigma	D9809	100 ng/ ml
Leukemia Inhibitory Factor	Sigma	L5158	20 ng/ ml
Vitronectin	Sigma	V0132	100 ng/ ml
Primary rat muscle differentiation medium
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500	N/A
Equipment
Class 2 red diode laser	Newport	N/A
Photo-detector	Noah Industries	N/A
Model 2100 Pulse stimulator	A-M systems	N/A
Multiclamp 700B Digitizer	Axon Instruments	N/A
Patch clamp microscope and stage	Olympus	N/A
Delta T4 culture dish controller	Bioptechs	N/A
Axoscope software	Molecular Devices	N/A
LabVIEW software	National Instruments	N/A
37oC, 5% CO2 incubator	NAPCO	N/A
Class 2 microbiological flow hood	Labconco	N/A
Pipettes and tips	Eppendorf	N/A