Bruken av<em> Ex Vivo</em> Chandler Loop Apparatus å vurdere Biokompatibilitet av modifiserte Polymer Blood slanger
Summary
Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.
Abstract
Den fremmedlegeme reaksjon oppstår når et syntetisk overflate innføres i kroppen. Den er karakterisert ved adsorpsjon av blodproteiner og den påfølgende feste og aktivering av blodplater, monocytt / makrofag adhesjon, og inflammatorisk cellesignale hendelser, som fører til post-komplikasjoner. Chandler Loop Apparatus er et eksperimentelt system som tillater forskere å studere de molekylære og cellulære interaksjoner som oppstår når store mengder blod er perfused over polymere rør. For dette formål, har denne anordning blitt brukt som en ex vivo-modell tillater vurdering av den anti-inflammatoriske egenskaper av forskjellige polymeroverflatemodifiseringer. Vårt laboratorium har vist at blod rør, kovalent modifiserte via fotoaktivering kjemi med rekombinant CD47, kan konferere biokompatibilitet til polymere overflater. Tillegg av CD47 til polymere overflater kan være et effektivt middel for å fremme effektiviteten av polymere blodledninger. HennesEin er metodikken detaljering fotoaktivering kjemi som brukes til å føye rekombinant CD47 til klinisk relevante polymere blodledninger og bruken av Chandler Loop som en ex vivo-forsøksmodell for å undersøke blod interaksjoner med CD47 modifisert og styreledninger.
Introduction
Mange kliniske prosedyrer, slik som kardiopulmonal bypass og renal dialyse, krever bruk av polymere blodledninger og er ofte forbundet med post-komplikasjoner en. Når perfundert med blod, disse polymerer illegale fremmedlegemet reaksjon (FBR), som resulterer i adsorpsjon av blodproteiner og blodplater, monocytter / makrofager heft, og utgivelsen av proinflammatoriske cytokiner, som alle bidrar til post-prosessuelle komplikasjoner og / eller enhetsfeil 2,3. Dermed strategier for å løse dette problemet fortsatt være en viktig og pågående område av biomaterialer forskning. Etterforskerne har forsøkt å løse dette problemet ved å endre blod kontakte flater med bioaktive eller bioinert molekyler 4-6. Forskning i vårt laboratorium har fokusert på å legge rekombinant CD47 (recCD47) til polymere biomaterialer som en strategi for å redusere FBR og øke effekten av disse materialene. CD47 er en ubiquitously uttrykt transmembrane protein med en kjent rolle i immununndragelser, overdragelse "selv" status ved å uttrykke celler 7-10 og show lover ved overdragelse biokompatibilitet når lagt til polymere overflater 11-13. Signal-regulatorisk protein alfa (SIRPα), den kognatreseptoren for CD47, og et medlem av immunoreceptor tyrosin baserte hemmende motiv (ITIM) -holdig familie av transmembrane proteiner, uttrykkes på celler av myeloid opprinnelse 14. Vi har tidligere vist at CD47, via SIRPα-mediert celle signalering, nedregulerer immunresponsen til polyuretan (PU) og polyvinylklorid (PVC) i in vitro, ex vivo, og in vivo-modeller 11-13.
Sentralt i våre undersøkelser er en relativt ny fotoaktivering kjemi, som her er beskrevet, i hvilken kjemisk reaktive tiolgrupper er kovalent føyes til polymere rør ved omsetning av slangen med en multifunksjonell polymer (PDT-BzPh), som består av 2-pyridylditio (PDT), den fotoreaktiv benzofenon (BzPh) og en karboksy-modifisert polyallylamin 11-13. Reduksjon av de kovalent vedføyde PDT grupper med tris (2-karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (TCEP) 11 gir en tiolerte overflate som kan være omsettes deretter med terapeutiske grupper. Detaljert heri tidligere og 12,13, recCD47, ytterligere modifisert ved tilsetning av et C-terminale poly-lysin halen 12,13, blir reagert med sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cykloheksan-1-karboksylat (sulfo-SMCC) i 1 time for å gi tiol-reaktive grupper, slik at for et monosulfid bindingsdannelse mellom slangen og recCD47 11. Den anti-inflammatoriske kapasiteten til CD47 funksjonaliserte overflater ble testet, ex viv o, ved hjelp av Chandler sløyfe-apparatur med humant fullblod, som opprinnelig ble beskrevet i 1958 som en in vitro modell av trombotisk 15 koagulasjon. Anordningen er avhengig av enlukkede rør-systemet delvis fylt med luft, og en roterende motor for å sirkulere blodet gjennom slangen 15.. Denne eksperimentelle modellen gir mulighet for å undersøke effekten av blod eksponering ved modifiserte og umodifiserte overflater, så vel som effekten av disse overflatemodifiseringer på fysiologien av celler i blod.
recCD47 kan legges til et utvalg av polymere overflater ved hjelp av denne fotoaktivering kjemi, og dens anti-inflammatorisk kapasitet kan bli vurdert ved å anvende en klinisk relevant ex vivo modell ligne blodperfusjon i løpet av polymere overflater 11,12. Kliniske karakterblodledninger modifisert med recCD47 viser vesentlig mindre blodplater og inflammatorisk cellefesting i forhold til ikke-modifiserte polymerer når de utsettes for menneskeblod i anordningen. En trinn-for-trinn-beskrivelse av denne endringen prosessen er beskrevet nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den fotoaktivering kjemi (oppsummert i figur 1) gir mulighet for endring av praktisk talt alle polymer overflate som har tilstrekkelige hydrokarboner å forenkle PDT-BzPh vedlegg og påfølgende UV bestråling til foto-aktivere PDT-BzPh. Funksjonalisepolymeroverflaten med reaktive tiolgrupper muliggjør den påfølgende binding av en rekke testbare molekyler av interesse. I våre spesielle studier valgte vi rekombinant CD47 11-13. Den spesielle konjugering kjemien at vi brukte involverte reak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-100G | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of ‘self’ engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
