사용<em> 전의 VIVO</em> 챈들러 루프 장치 수정 된 고분자 혈액 도관의 생체 적합성을 평가하기 위해
Summary
Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.
Abstract
합성 체 표면에 도입 될 때 이물 반응이 일어난다. 이 시술 후 합병증으로 이어지는, 혈액 단백질의 흡착 및 혈소판의 후속 부착 및 활성화, 단핵구 / 대 식세포 접착 및 염증 세포의 신호 이벤트에 의해 특징입니다. 챈들러 루프 장치 연구자들은 혈액의 많은 양이 고분자 도관을 통해 관류 때 발생하는 분자 및 세포의 상호 작용을 연구 할 수있는 실험 시스템입니다. 이를 위해, 본 장치는 다양한 중합체 표면 변형 항염의 평가를 허용하는 생체 외 모델로 사용되고있다. 우리 연구실은 공유 재조합 CD47와 photoactivation 화학을 통해 수정 된 혈액 도관, 고분자 표면에 생체 적합성을 부여 할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 고분자 표면에 CD47를 추가하는 것은 중합체 혈액 도관 효능을 촉진 할 수있는 효과적인 수단이 될 수있다. 그녀의EIN은 CD47 변성 및 제어 도관과 혈액의 상호 작용을 조사하는 임상 적으로 중요한 중합체 혈액 도관 및 생체 외 실험 모델로서 챈들러 루프의 사용 재조합 CD47을 추가하는 데 사용 photoactivation 화학 디테일 방법론이다.
Introduction
그러한 체외 순환 및 신장 투석과 같은 많은 임상 절차, 중합체 혈액 도관의 사용을 필요로하고 종종 시술 후 합병증 1과 연관된다. 혈액 관류 할 때,이 폴리머는 혈액 단백질 및 혈소판, 단핵구 / 대식 세포 접착의 흡착 결과, 이물 반응 (FBR)를 이끌어 낼, 그리고 할 시술 후 합병증에 기여 모두 염증성 사이토 카인의 방출 / 또는 장치 고장 2,3. 따라서, 이러한 문제를 해결하기위한 전략은 생체 재료 연구의 중요한 영역 및 지속적인 유지. 연구자들은 생리 활성 또는 생체 불활성 분자 4-6 혈액 접촉면을 수정하여이 문제를 해결하려고했습니다. 우리의 실험실에서 연구는 FBR을 완화하고 이들 물질의 효능을 증가시키기위한 전략으로 고분자 생체 재료에 재조합 CD47 (recCD47를) 추가에 초점을 맞추고있다. CD47는 재하 표현 transmembr입니다세포 7-10와 쇼를 표현하는시의 면역 회피의 알려진 역할 부여 "자기"상태 메탄 단백질은 고분자 표면에 11 ~ 13에 추가 할 때 생체 적합성을 부여에 약속드립니다. 신호 규제 단백질 알파 (SIRPα), CD47에 대한 동족 수용체 및 횡단 단백질의 가족을 함유 면역 수용체 티로신 기반의 억제 모티프 (ITIM)의 회원은 골수 기원 (14)의 세포에 표현된다. 우리는 이전에 CD47가 SIRPα 매개 세포 신호를 통해, 생체 외, 생체 폴리 우레탄 (PU)와 폴리 염화 비닐 (PVC)에 대한 면역 반응을 하향 조정하고 생체 내 모델 11-13에 있음을 증명하고있다.
우리의 조사에 중앙 화학적으로 반응성 티올 그룹이 공유 다기능 고분자 (PDT-의 BZ와 튜브를 반응시켜 고분자 튜브에 추가되는 여기에 설명 된 비교적 새로운 photoactivation 화학은있다2 – 피리 딜 디티 오 (PDT)로 이루어지는) 액, 광 반응성 페논 (BzPh) 및 카르복시 변성 폴리 알릴 11-13. 트리스 함께 공유 첨부 PDT기를 환원 (2 – 카르복시 에틸) 포스 핀 히드로 클로라이드 (TCEP)는 11 일 이후 일 수 티올 표면은 치료 잔기와 반응하여 산출한다. 본원 이전 상세한 12,13, 상기 C-말단 폴리 – 리신 12,13 꼬리의 첨가로 개질 recCD47는, Sulfosuccinimidyl – 4 – [N -maleimidomethyl] 시클로 헥산 카르 복실 레이트 1과 반응 (술포-SMCC) 1 시간 동안 튜브 (11) 사이 및 recCD47 우람 모노 설파이드 결합 형성을 허용 티올 반응성기를 생성한다. CD47의 표면 기능화 항염증제 용량은 원래 응고 혈전 (15)의 시험 관내 모델로서 1958 년에 설명 된 전체 인간 혈액과 챈들러 루프 장치를 이용하여, 전 비브 O, 시험 하였다. 장치에 의존밀폐 된 튜브 시스템은 부분적으로 공기 튜브 (15)를 통해 혈액을 순환하는 회전 모터 가득합니다. 이 실험 모델 수정 및 표면 개질시 혈액 노출의 효과뿐만 아니라, 혈액 세포의 생리학에 따라 그 표면 변형의 영향을 조사 할 수있는 기회를 제공한다.
recCD47이 photoactivation 화학을 사용하여 중합체의 다양한 표면에 추가 될 수 있고, 그것의 항 염증 능력은 중합체 표면 (11, 12)를 통해 혈류를 흉내 임상 적으로 중요한 생체 모델을 이용하여 평가 될 수있다. 장치에서 인간의 혈액에 노출되었을 때 변성 중합체에 비해 recCD47 변성 임상 등급의 혈액 도관은 상당히 적은 혈소판과 염증 세포 부착을 보여준다. 본 변형 과정의 단계별 설명은 아래에 자세히 설명된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
(그림 1에 요약) photoactivation의 화학에 대한 PDT-BzPh 첨부 및 후속 UV 조사 용이하게하기 위해 충분한 탄화수소가 거의 모든 고분자 표면의 수정을 허용 PDT-BzPh을 사진을 활성화. 반응성 티올 그룹과 고분자 표면을 기능화하는 것은 관심의 검증 가능한 분자의 범위의 후속 첨부 할 수 있습니다. 우리의 특정 연구에서 우리는 재조합 CD47 11 ~ 13을 선택했다. 우리는 이관 능성 가교 링…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-100G | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of ‘self’ engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
