Brug af den<em> Ex vivo</em> Chandler Loop Apparat til Vurdere biokompatibilitet modificerede Polymere Blood Kanaler
Summary
Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.
Abstract
Det fremmede organ reaktion opstår, når en syntetisk overflade indføres i kroppen. Det er karakteriseret ved adsorption af blodproteiner og den efterfølgende binding og aktivering af blodplader, monocyt / makrofag adhæsion og inflammatoriske celle signalering begivenheder, der fører til post-proceduremæssige komplikationer. The Chandler Loop Apparatur er et eksperimentelt system, der gør det muligt for forskerne at studere de molekylære og cellulære samspil, der opstår, når store mængder af blod perfunderet løbet polymere ledninger. Med henblik herpå er apparatet blevet anvendt som en ex vivo model, der tillader en vurdering af de anti-inflammatoriske egenskaber af forskellige polymer overflademodifikationer. Vores laboratorium har vist, at blod ledninger, kovalent modificeret via fotoaktivering kemi med rekombinant CD47, kan give biokompatibilitet til polymere overflader. Tilføjelse CD47 til polymere overflader kan være et effektivt middel til at fremme effektiviteten af polymere blod ledninger. Hendesein er den metode beskriver fotoaktiveringsprogrammet kemi anvendes til at tilføje rekombinant CD47 klinisk relevante polymere blod kanaler og brug af Chandler Loop som en ex vivo eksperimentel model til at undersøge blod interaktioner med CD47 modificeret og kontrol ledningerne.
Introduction
Mange kliniske procedurer, såsom hjerte-lunge bypass og dialyse, kræver brug af polymere blod ledninger og er ofte forbundet med post-proceduremæssige komplikationer 1. Når perfunderet med blod, disse polymerer ulovlig fremmedlegemekapslen reaktion (FBR), hvilket resulterer i adsorption af blod proteiner og blodplader, monocytter / makrofager vedhæftning, og frigivelsen af pro-inflammatoriske cytokiner, som alle bidrager til post-processuelle komplikationer og / eller fiasko anordning 2,3. Således strategier til at løse dette problem er fortsat et vigtigt og aktuelt interesseområde biomaterialer forskning. Efterforskere har forsøgt at løse dette problem ved at ændre blod kontakt overflader med bioaktive eller bioinert molekyler 4-6. Forskning i vores laboratorium har fokuseret på at tilføje rekombinant CD47 (recCD47) til polymere biomaterialer som en strategi for at afbøde FBR og øge effektiviteten af disse materialer. CD47 er en ubikvitært udtrykt transmembrane protein med en kendt rolle i immun svig, der giver "selv"-status ved at udtrykke celler 7-10 og viser lover at overdrage biokompatibilitet når vedlagt polymere overflader 11-13. Signal-regulatorisk protein alfa (SIRPα), den beslægtede receptor for CD47, og et medlem af immunoreceptor tyrosin-baserede inhibitoriske motiv (ITIM) holdig familien af transmembrane proteiner, udtrykkes på celler af myeloid oprindelse 14. Vi har tidligere vist, at CD47 via SIRPα-medieret celle signalering, nedregulerer immunreaktioner på polyurethan (PU) og polyvinylchlorid (PVC) i in vitro, ex vivo og in vivo modeller 11-13.
Centralt for vores undersøgelser er en relativt ny fotoaktivering kemi, der er beskrevet heri, hvori kemisk reaktive thiolgrupper er covalent knyttet til polymerslange ved omsætning af slangen med en multifunktionel polymer (PDT-BzPh), sammensat af 2pyridyldithio (PDT), den fotoreaktive benzophenon (BzPh) og en carboxy-modificeret polyallylamin 11-13. Reduktion af kovalent vedhæftede PDT grupper med tris (2-carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (TCEP) 11 giver et thioleret overflade, som efterfølgende kan omsættes med terapeutiske dele. Detaljeret heri og tidligere 12,13, recCD47 yderligere modificeret med tilføjelse af en C-terminal poly-lysin hale 12,13, omsættes med sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexan-1-carboxylat (sulfo-SMCC) i 1 time til at generere thiol-reaktive grupper, der giver mulighed for en formation monosulfide binding mellem slangen og recCD47 11. Den anti-inflammatoriske kapacitet i CD47 funktionaliserede overflader blev testet, ex viv o ved hjælp af Chandler Loop Apparater med humant fuldblod, som oprindeligt blev beskrevet i 1958 som en in vitro model af trombotisk koagulation 15. Apparatet er baseret på enlukket system rør delvist fyldt med luft, og en roterende motor til at cirkulere blodet gennem slangen 15. Denne eksperimentelle model giver mulighed for at undersøge effekten af blod eksponering på modificerede og umodificerede overflader samt effekten af disse overflademodifikationer på fysiologi af celler i blodet.
recCD47 kan føjes til en bred vifte af polymere overflader ved hjælp af denne fotoaktiveringsprogrammet kemi og dens anti-inflammatoriske kapacitet kan vurderes ved at anvende en klinisk relevant ex vivo model efterligner blodperfusion løbet polymere overflader 11,12. Klinisk kvalitet blod ledninger modificeret med recCD47 signifikant mindre blodplader og inflammatorisk cellevedhæftning sammenlignet med umodificerede polymerer, når de udsættes for humant blod i apparatet. En trin-for-trin beskrivelse af denne modifikation proces er nærmere beskrevet nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fotoaktiveringsprogrammet kemi (opsummeret i figur 1) giver mulighed for ændring af næsten enhver polymer overflade, der har tilstrækkelige kulbrinter til at lette PDT-BzPh udlæg og efterfølgende UV-bestråling til foto-aktivere PDT-BzPh. Funktionalisering polymeroverfladen med reaktive thiolgrupper giver mulighed for efterfølgende fastgørelse af en række afprøves molekyler af interesse. I vores særlige undersøgelser valgte vi rekombinant CD47 11-13. Den særlige konjugationskemi s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Scientific | 58906 | Caution! Use in fume hood |
| 25% Glutaraldehyde | VWR | AAA17876-AP | Caution! Use in fume hood |
| 2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH) | Synthesized in lab | N/A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059-100G | |
| Citrate | Sigma | S5770-50ML | |
| Digital Camera | Leica | DC500 | Out of production |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | 270547-100ML | Caution! Use in fume hood |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco/Life Technologies | 14190-136 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TE300 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | Caution! Use in fume hood |
| Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-12730 | |
| Osmium Tetroxide | Acros Organics | 197450050 | Caution! Use in fume hood |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3) | Sigma | 237205-100G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655-100G | |
| PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit) | Terumo Cardiovascular Systems | 60050 | Most clinical-grade tubing will work |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | JSM-T330A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | Spectramax Gemini EM | |
| Sulfo-SMCC | Sigma | M6035-10MG | Moisture Sensitive! |
| tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | |
| Tris Base | Sigma | T1503-100G | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531 | |
| Vectashield with DAPI | Fisher Scientific | H-1200 | Light sensitive! |
| Zeba Spin Desalt Columns – 7K MWCO | Thermo Scientific | 89891 |
References
- Bruck, S. D. Medical applications of polymeric materials. Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Levy, J. H., Tanaka, K. A. Inflammatory response to cardiopulmonary bypass. Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).
- Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces. Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).
- Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers. Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).
- Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha. Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).
- Tsai, R. K., Discher, D. E. Inhibition of ‘self’ engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells. J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).
- Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).
- Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
- Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).
- Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).
- Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).
- Ravetch, J. V., Lanier, L. L. Immune inhibitory receptors. Science. 290, 84-89 (2000).
- Chandler, A. B. In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus. Lab Invest. 7, 110-114 (1958).
- Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression. Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., Fainerman, V. B., Wüstneck, R., Krägel, J., Trukhin, D. V. Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).
- Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. Int J Biomater. 2012, (2012).
