오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
폐렴 구균, 비 인두의 polymicrobial 지역 사회의 일반적인 식민지 개척자는, 세균 생성 된 항균 펩타이드 (박테리오신)의 생산을 통해 다른 폐렴 구균과 밀접하게 관련 종과 경쟁 할 수있다. 현재까지 조사마다 완전히 순서가 폐렴 구균 균주는 B의 acteriocin- 리터의 이케 페이지의 eptide 궤적, BLP의 버전이 포함되어 있습니다. 폐렴 구균에 의하여 생산 박테리오신은 양의 시험 관내 결과 및 생체 내 경쟁 1-4에 중요한 것으로 입증되었다. 경쟁적인 역학 특정 펩티드 페로몬에 응답하여 동족 내성 단백질과 함께 다양한 박테리오신의 발현에 의해 영향을 받는다. BLP 궤적 유도 펩티드 페로몬, BlpC는, 센서 키나아제, BlpH에 결합되는 정족수 인식 시스템에 의해 제어하고, 그 결과 신호 캐스케이드를 개시한다BLP 궤적 5,6의 전사. BlpC의 사 대립 유전자 변형이 있습니다 자사의 동족 BlpH 6 각 바인드. 셀 자체 박테리오신의 효과 살아남 들어 동족 내성 단백질을 인코딩하는 유전자는 유전자 박테리오신 각각 같은 오페론에 전사된다. 변형 방지에 필요한 특정 내성 유전자를 결여하는 경우 경쟁자 균주는 외인성 페로몬에 응답 BLP 궤적을 상향 조절 할 수없는 경우, 또는 죽이는 발생한다. 수송 복합체, BlpAB이 분비 및 처리 펩타이드 페로몬과 박테리오신 펩티드 2,4 필요합니다. 최근에는 폐렴 구균 균주의 상당한 부분들이없는 그들과 박테리오신 1,2 페로몬 분비 렌더링 blpA 유전자의 보존 된 돌연변이를 의미하는 "사기꾼"가 있다고 밝혀졌다. 이 균주는 울음 소리에 의해 분비되는 외인성 BlpC 2에 응답 할 수 있습니다면역 단백질의 생산을 허용 보링 균주.
상청액으로부터 박테리오신의 조질 제제는 순도를 달성하는 생화학 방법의 단계를 사용하여 제조자 균주로부터 제조 될 수 있지만,이 방법은 균주의 큰 컬렉션을 스크리닝 유용한 아니며 박테리오신 발현 수준은 국물 성장 배양 낮은 경우 2,7- 9. 오버레이 분석은 시험 관내에 존재할 수있는 균주간에 경쟁 역학 조사 신속한 방법으로 사용된다. 그렇게하려면, 폐렴 구균 균주는 미리 접종 한천 플레이트 상과 BLP 궤적의 유도에 충분한 로컬 박테리아 농도를 달성하기 위해 증가시킨다. 두 번째 변형은 다음 다음 감도를 테스트 할 수있는 사전 접종 균주에 걸쳐 적용되는 용융 부드러운 한천 솔루션에 접종한다. (억제 활성 무관) BLP 궤적 행위 평가하기 위해 균주 번째 일련의 오버레이 할 수이전에 설명 BlpC 기자 균주를 REE. 이 균주는 폐렴 구균에 의해 분비되는 가장 일반적인 세 BlpC 페로몬에 반응 세 가지 blpH 대립 유전자 중 하나를 포함하도록 구성되었다. 리포터 균주 BlpH 의존 프로모터의 제어하에 있고 자기 자극을 방지 10,11 blpC 유전자에서 삭제를 수행하는 통합의 lacZ 유전자를 가지고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 오버레이 분석은 박테리오신 생산자 활동의 범위를 결정하고 폐렴 구균 균주 사이에서 발생할 수있는 경쟁적인 상호 작용을 보여주기 위해 빠른 방법이다. 오버레이 분석은 하나의 플레이트에 대한 여러 박테리오신 생산 균주 선별을 위해 사용하도록 구성 될 수있다. 우리는 성공적으로 96 웰 플레이트의 절반에서 SBA 판을 접종 48 핀 복제기를 사용하여이 분석에 큰 부담 모음을 상영했다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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