Использование наложения Пробирной для Качественно Измерьте бактериальной продукции и чувствительность к пневмококковой Бактериоцины
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Пневмококк, общая колонизатор полимикробной сообщества носоглотки, способен конкурировать с другими пневмококков и близкородственных видов путем производства бактериально производства антимикробных пептидов (Бактериоцины). Каждый полностью секвенировали пневмококковой штамм на сегодняшний момент содержит версию б acteriocin- л Айк р eptide локуса, BLP. Бактериоцин производство по пневмококка была продемонстрирована быть важно в исходе как в пробирке и в естественных условиях конкуренции 1-4. Конкурентные динамика под влиянием экспрессии различных бактериоцинов наряду с родственными белками иммунитета в ответ на конкретный пептидной феромона. Индукция BLP локуса контролируется кворума системы зондирования, в котором пептид феромон, BlpC, связывается с киназы датчика, BlpH, и инициирует сигнальный каскад, что приводит ктранскрипция BLP локуса 5,6. Существуют четыре аллельные вариации BlpC, что каждый связываются с родственным BlpH 6. Для клеток, чтобы выжить эффекты собственной бактериоцина, гены, которые кодируют белки, родственные иммунитета транскрибируются на той же оперона в качестве каждого из генов бактериоциновых. Уничтожение происходит, если штамм конкурент не может положительно регулировать в BLP локус в ответ на экзогенный феромона, или, если штамм не имеет конкретный ген иммунитета, необходимого для защиты. Транспортер комплекс, BlpAB требуется для секреции и обработки пептидного феромона и бактериоцина пептидов 2,4. Недавно было показано, что значительная доля пневмококковых штаммов "мошенники", то есть они имеют сохраняющуюся мутацию в гене blpA что делает их не в состоянии выделять феромоны и бактериоцинами 1,2. Эти штаммы способны реагировать на внешнее BlpC 2 секретируется ржутрасточные штаммы, позволяющие для производства иммунитета белков.
Хотя, неочищенные препараты бактериоцинов из супернатантов могут быть получены из штаммов-продуцентов с помощью биохимических методов шаги, чтобы достичь чистоты, этот подход не является полезным для скрининга больших коллекции штаммов, и если уровень экспрессии бактериоцина низка в бульоне выращивают культур 2,7- 9. Наложение анализ используют в качестве быстрого способа исследовать динамику конкуренции между штаммами, которые могут существовать в пробирке. Чтобы сделать это, пневмококковой деформации предварительно высевали на чашку с агаром и давали им расти, чтобы достичь местных бактериальных концентрации, достаточные для индукции BLP локуса. Второй штамм затем инокулировали в мягком агаре расплавленного раствора, который затем наносили на предварительно заражают штаммом для проверки чувствительности. Для оценки для деятельности BLP локуса (независимо от ингибиторной активности), штаммы могут быть наложены с серией гоРи, описанные ранее штаммов репортер BlpC. Эти штаммы были построены, чтобы содержать один из трех различных аллелей blpH, которые отвечают на трех наиболее распространенных феромонов BlpC секретируемых пневмококков. Штаммы репортер имеют встроенный ген LacZ, который находится под контролем BlpH зависимого промотора и ношение удаление в гене blpC что предотвращает самостимуляция 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это наложение анализ является быстрый способ определить диапазон деятельности для производителей бактериоциновых и продемонстрировать конкурентные взаимодействия, которые могут возникнуть между пневмококковых штаммов. Наложение анализ может быть выполнен с возможностью использо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
