ओवरले परख का उपयोग गुणात्मक न्यूमोकोकल बैक्टीरियोसिन्स को बैक्टीरियल के उत्पादन और संवेदनशीलता उपाय
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया, nasopharynx की polymicrobial समुदाय के एक आम उपनिवेशवादी, bacterially उत्पादन रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स (बैक्टीरियोसिन्स) के उत्पादन के माध्यम से अन्य pneumococci और निकट से संबंधित प्रजातियों के साथ प्रतिस्पर्धा करने में सक्षम है. तारीख करने के लिए जांच की हर पूरी तरह से अनुक्रम न्यूमोकोकल तनाव बी acteriocin- एल आइक पी eptide ठिकाना, BLP का एक संस्करण है. Pneumococcus द्वारा Bacteriocin उत्पादन दोनों में इन विट्रो के परिणाम में और vivo प्रतियोगिता 1-4 में महत्वपूर्ण होने के लिए प्रदर्शन किया गया है. प्रतियोगी गतिशीलता एक विशिष्ट पेप्टाइड फेरोमोन के जवाब में आत्मीय प्रतिरक्षा प्रोटीन के साथ साथ विविध बैक्टीरियोसिन्स की अभिव्यक्ति से प्रभावित हैं. BLP लोकस की प्रेरण एक पेप्टाइड फेरोमोन, BlpC, सेंसर काइनेज, BlpH को बांधता है, जिसमें एक कोरम संवेदन प्रणाली द्वारा नियंत्रित है, और जिसके परिणामस्वरूप में एक संकेत झरना शुरू की हैBLP ठिकाना 5,6 के प्रतिलेखन. BlpC के चार allelic भिन्नता है कि अपने आत्मीय BlpH 6 के लिए प्रत्येक बाँध. सेल अपनी ही bacteriocin का प्रभाव जीवित रहने के लिए, आत्मीय प्रतिरक्षा प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि जीन bacteriocin जीनों में से प्रत्येक के रूप में एक ही operon पर लिखित हैं. तनाव संरक्षण के लिए आवश्यक विशिष्ट उन्मुक्ति जीन का अभाव है अगर एक प्रतियोगी तनाव, बहिर्जात फेरोमोन के जवाब में BLP ठिकाना upregulate करने में सक्षम नहीं है या अगर हत्या होती है. ट्रांसपोर्टर जटिल, BlpAB स्राव और प्रसंस्करण पेप्टाइड फेरोमोन की और bacteriocin पेप्टाइड्स 2,4 के लिए आवश्यक है. हाल ही में, यह न्यूमोकोकल उपभेदों का एक महत्वपूर्ण अनुपात वे उन्हें असमर्थ फेरोमोन और बैक्टीरियोसिन्स 1,2 छिपाना renders जो blpA जीन में एक संरक्षित उत्परिवर्तन है जिसका अर्थ है "धोखेबाज" हैं कि दिखाया गया है. इन उपभेदों पड़ोसी द्वारा स्रावित बहिर्जात BlpC 2 के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैंप्रतिरक्षा प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुमति उबाऊ उपभेदों.
Supernatants से बैक्टीरियोसिन्स की, कच्चे तेल की तैयारी पवित्रता प्राप्त करने के लिए जैव रासायनिक विधियों चरणों का उपयोग उत्पादक उपभेदों से तैयार किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण वियोजन के बड़े संग्रह स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी नहीं है और bacteriocin अभिव्यक्ति के स्तर शोरबा हो गई संस्कृतियों में कम है 2,7- 9. ओवरले परख इन विट्रो में मौजूद हो सकता है कि उपभेदों के बीच प्रतिस्पर्धी गतिशीलता की जांच के लिए एक तेजी से रास्ते के रूप में प्रयोग किया जाता है. ऐसा करने के लिए, एक न्यूमोकोकल तनाव पूर्व टीका एक अगर प्लेट पर और BLP लोकस की प्रेरण के लिए पर्याप्त स्थानीय बैक्टीरियल सांद्रता को प्राप्त करने के लिए विकसित करने की अनुमति दी है. एक दूसरे तनाव तो फिर संवेदनशीलता के लिए परीक्षण करने के लिए पूर्व टीका तनाव पर लागू होता है जो एक पिघला हुआ नरम अगर समाधान में टीका है. (निरोधात्मक गतिविधि की स्वतंत्र) BLP लोकस की गतिविधि के लिए मूल्यांकन करने के लिए, उपभेदों वीं की एक श्रृंखला के साथ मढ़ा जा सकता हैपहले से वर्णित BlpC रिपोर्टर उपभेदों REE. इन उपभेदों pneumococci द्वारा स्रावित तीन सबसे आम BlpC फेरोमोन का जवाब है कि तीन अलग blpH alleles में से एक को रोकने के लिए निर्माण किया गया. रिपोर्टर उपभेदों एक BlpH निर्भर प्रमोटर के नियंत्रण में है और आत्म उत्तेजना 10,11 रोकता है blpC जीन में एक विलोपन ले कि एक एकीकृत lacZ जीन है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस उपरिशायी परख bacteriocin उत्पादकों के लिए गतिविधि की सीमा निर्धारित करने के लिए और न्यूमोकोकल उपभेदों के बीच उत्पन्न हो सकने वाली प्रतिस्पर्धी बातचीत प्रदर्शित करने के लिए एक तेजी से रास्ता है. ओवरले परख …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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