Bruke overlegg analysen til Kvalitativt Mål Bakteriell Produksjon av og følsomhet for pneumokokk Bakteriociner
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, en vanlig colonizer av blandingsflora fellesskap av nese-svelgrommet, er i stand til å konkurrere med andre pneumokokker og nært beslektede arter gjennom produksjon av bacterially produsert antimikrobielle peptider (bakteriociner). Hver fullt sekvensert pneumokokk belastning undersøkt hittil inneholder en versjon av b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Bakteriocinproduksjonen ved pneumococcus har vist seg å være viktig i utfallet av både in vitro og in vivo konkurranse 1-4. Konkurrerende dynamikk blir påvirket av ekspresjonen av forskjellige bakteriociner sammen med beslektede proteiner immunitet som respons på et spesifikt peptid feromon. Induksjon av BLP-locus er kontrollert av en quorums- følersystem, hvor et peptid feromon, BlpC bindes til sensoren kinase, BlpH, og initierer en signalkaskade som resulterer itranskripsjon av BLP locus 5,6. Det er fire allele varianter av BlpC at hvert bind til kognatreseptoren BlpH seks. For cellen til å overleve virkningen av sin egen bakteriocin, er gener som koder for beslektede proteiner immunitetstranskribert i samme operon som hver av bakteriocinet gener. Killing oppstår hvis en konkurrent belastningen er ikke i stand til å oppregulere BLP locus som respons på eksogen feromon eller, hvis belastningen mangler spesifikk immunitet genet som kreves for beskyttelse. Transportøren kompleks, er BlpAB nødvendig for sekresjon og prosessering av peptidet feromon og bakteriocinet peptider 2,4. Nylig har det blitt vist at en betydelig andel av pneumokokkstammer er "cheaters" betyr at de har en konservert mutasjon i blpA genet som gjør dem ute av stand til å utskille feromoner og bakteriociner 1,2. Disse stammer er i stand til å svare på eksogen BlpC 2 utskilt av vrinskkjedelige stammer som muliggjør produksjon av immunitets proteiner.
Selv, rå preparater av bakteriosinene fra supernatants kan tilberedes fra produsent stammer bruker biokjemiske metoder skritt for å oppnå renhet, er denne tilnærmingen ikke nyttig for screening store samlinger av isolater og dersom nivået av bakteriocinproduksjonen uttrykk er lav i buljong vokst kulturer 2,7- 9. Overleggs assay brukes som en hurtig måte til å undersøke de konkurrerende dynamikk mellom stammer som kan finnes in vitro. For å gjøre dette, er et pneumokokk stamme pre-inokulert på en agar-plate og tillatt å vokse for å oppnå lokale bakterielle konsentrasjoner som er tilstrekkelig for induksjon av BLP locus. En annen stamme ble deretter inokulert i en smeltet bløt agar-løsning som påføres deretter over den forhånds inokulert belastning for å teste følsomheten. For å evaluere om aktiviteten til BLP locus (uavhengig av hemmende aktivitet), kan påkjenningen bli belagt med en serie three tidligere beskrevet BlpC reporter stammer. Disse stammene var konstruert for å inneholde en av tre forskjellige blpH alleler som reagerer på de tre vanligste BlpC feromoner skilles ut av pneumokokker. Rapportør-stammer har en integrert lacZ-genet som er under kontroll av en BlpH avhengige promotor og bærer en delesjon i genet blpC som forhindrer selvstimulering 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne overlay-analysen er en rask måte å bestemme området for aktivitet for bakteriocinløsning produsenter og å vise et bredt interaksjoner som kan forekomme blant pneumokokkstammer. Det overliggende assay kan tilpasses til bruk for screening av flere stammer for bakteriocinproduksjonen på en enkelt plate. Vi har med hell vist store strekk samlinger med dette assay ved å bruke en 48-pinners replikator å inokulere SBA platene fra den ene halvdel av en 96-brønns plate. Etter inkubering over natten, blir veksten o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
