Använda Overlay-analys för att Kvalitativt Mät Bakteriell Produktion av och känslighet för pneumokockinfektioner bakteriociner
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, en gemensam kolonisatör av polymikrobiella gemenskap nasofarynx, kan konkurrera med andra pneumokocker och närbesläktade arter genom produktion av bakteriellt producerade antimikrobiella peptider (bakteriociner). Varje fullt sekvenser pneumokock-stammen undersöktes hittills innehåller en version av b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Bakteriocinet produktion med pneumokocker har visat sig vara viktiga i resultatet av både in vitro och in vivo konkurrens 1-4. Konkurrensutvecklingen påverkas av uttrycket av olika bakteriociner tillsammans med besläktade immunitets proteiner som svar på en specifik peptid feromon. Induktion av BLP lokus styrs av en quorum sensing system, i vilket en peptid feromon, BlpC, binder till sensorn kinas, BlpH, och initierar en signaleringskaskad som resulterar i dentranskription av BLP locus 5,6. Det finns fyra alleliska variationer av BlpC att varje binder till dess besläktade BlpH 6. För cellen att överleva effekterna av sin egen bakteriocin är de gener som kodar för besläktade immunitetsproteiner transkriberas på samma operon som var och en av de bakteriocin gener. Dödande uppstår om en konkurrent-stam inte är i stånd att uppreglera BLP lokus som svar på exogent feromon eller, om stammen saknar specifik immunitet genen krävs för skydd. Transportören komplexet, BlpAB erfordras för utsöndring och bearbetning av peptiden feromon och bakteriocinet peptiderna 2,4. Nyligen har det visats att en betydande andel av pneumokockstammar är "fuskare" innebär att de har en konserverad mutation i blpA gen som gör dem oförmögna att utsöndra feromoner och bakteriociner 1,2. Dessa stammar har möjlighet att svara på exogen BlpC 2 utsöndras av gnäggatråkiga stammar som möjliggör produktion av immunitets proteiner.
Även om, råa beredningar av bakteriociner från supernatanter kan framställas från producentstammar använder biokemiska metoder steg för att uppnå renhet, är detta tillvägagångssätt inte är användbart för att screena stora samlingar av isolat, och om nivån av bakteriocinet uttryck är lågt i buljong odlade kulturer 2,7- 9. Den överliggande analysen används som ett snabbt sätt att undersöka konkurrensdynamiken mellan stammar som kan finnas in vitro. För att göra detta är en pneumokock stam förväg ympas på en agarplatta och fick växa för att uppnå lokala bakterie tillräckliga koncentrationer för induktion av BLP locus. En andra stammen inokuleras sedan i en smält mjukagar lösning vilken sedan appliceras över pre-ympades stam för att testa för känslighet. För att utvärdera om aktiviteten i BLP locus (oberoende av hämmande aktivitet), kan stammar överlagras med en serie av three tidigare beskrivna BlpC reporterstammar. Dessa stammar konstruerades för att innehålla en av tre olika blpH alleler som svarar på de tre vanligaste BlpC feromoner utsöndras av pneumokocker. Reporter stammar har en integrerad lacZ-gen som är under kontroll av en BlpH beroende promotorn och bär en deletion i blpC genen som förhindrar självstimulering 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna overlay-analys är ett snabbt sätt att bestämma området för aktivitet för bakteriocin producenter och visa konkurrenskraftiga interaktioner som kan uppstå bland pneumokockstammar. Den över analysen kan anpassas för att användas för screening av flera stammar för bakteriocin produktion på en enda skylt. Vi har framgångsrikt screenas stora töjnings samlingar med denna analys genom att använda en 48-pin replicator att inokulera SBA-plattor från en halv av en 96-brunnars platta. Efter inkubation över …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
