Summary
الموصوفة هنا هي طريقة لكشف وقياس بروتينات الميتوكوندريا الغشاء الخارجي immunolabeling الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليل التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يمكن أن تمتد لتقييم الجوانب الفنية من مجموعات سكانية فرعية الميتوكوندريا.
Abstract
طرق لكشف ورصد مكونات الميتوكوندريا البروتين الغشاء الخارجي في الأنسجة الحيوانية ضرورية لدراسة علم وظائف الأعضاء الميتوكوندريا والفيزيولوجيا المرضية. يصف هذا البروتوكول تقنية حيث يتم immunolabeled الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. يتم عزل الميتوكوندريا من القوارض النخاع الشوكي وتعرض لخطوة تخصيب السريعة وذلك لإزالة النخاعين، ملوثا خطيرا الكسور الميتوكوندريا أعدت من النسيج العصبي. ثم وصفت الميتوكوندريا المعزولة مع الأجسام المضادة الاختيار ومجموعة الضد الثانوية مترافق fluorescently. تحليل التدفق الخلوي يتحقق نقاء النسبي الاستعدادات الميتوكوندريا بواسطة تلطيخ مع صبغة محددة الميتوكوندريا، تليها الكشف النوعي والكمي للبروتين immunolabeled. هذه التقنية هي سريعة، وقابلة للقياس الإنتاجية العالية، مما يسمح لتحليل مئات الآلاف من الميتوكوندريا في العينة. فإنه ينطبق على تقييم الرواية صroteins على سطح الميتوكوندريا تحت الظروف الفسيولوجية العادية وكذلك البروتينات التي قد تصبح mislocalized لهذه العضية خلال علم الأمراض. الأهم من ذلك، يمكن أن يقترن هذا الأسلوب لمؤشر الأصباغ الفلورية أن يقدم تقريرا عن أنشطة بعض المجموعات السكانية الفرعية الميتوكوندريا وممكنا لالميتوكوندريا من الجهاز العصبي المركزي (الدماغ والحبل الشوكي)، وكذلك الكبد.
Introduction
الميتوكوندريا هي عضيات ديناميكية للغاية التي تخضع لجولات متعددة من الانشطار والانصهار، ويتم نقلها إلى مواقع من ارتفاع الطلب على الطاقة والاستجابة السريعة لمحفزات الفسيولوجية 1. لأنه يتزايد الاعتراف بأن الميتوكوندريا داخل الأنسجة المختلفة، مقصورات الخلوية حتى مختلفة، لديها ملامح وظيفية متميزة، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة لتحديد هذه الميتوكوندريا مجموعات فرعية متميزة.
يوفر المجهري وسيلة يمكن من خلالها تصور الميتوكوندريا الفردية ووجود بروتين في أو في الميتوكوندريا يمكن تحديده من خلال المناعي 2. ومع ذلك، والتحليل الكمي من هذا الأسلوب هو عمالة كثيفة وأكثر ملاءمة للتجارب باستخدام خطوط الخلايا خلد أو الأولية. دراسة الميتوكوندريا الفردية المستمدة من الأنسجة بشكل ملحوظ أكثر صعوبة ومعظم الطرق لا تسمح لسهولة تحديد مجموعات فرعية الميتوكوندريا بالتزامن مع evaluأوجه من وظيفة الميتوكوندريا 3.
من أجل معالجة هذه العقبة، طريقة جديدة لimmunolabel الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليلها لاحقا من قبل التدفق الخلوي تم تطويره. وهذا يسمح للكشف السريع والكمي للبروتينات مترجمة إلى الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما مقارنة التحليل المجهري، هو أقل بكثير كثيفة العمالة ويسمح تحليل الآلاف من الميتوكوندريا في عينة واحدة. ويمكن تطبيق هذا الاختبار لمراقبة مصير وقدر نسبي من الميتوكوندريا بروتينات الغشاء الخارجي التي يعتقد أن تكون موجودة جوهري في الميتوكوندريا، وتعيين من البروتينات على سطح الميتوكوندريا، أو الكشف عن البروتينات mislocalized إلى الميتوكوندريا في الحالات المرضية. وعلاوة على ذلك، فإن إدماج التقليدية الأصباغ الفلورية مؤشر يسمح بتقييم وقت واحد من جوانب معينة من وظيفة الميتوكوندريا في الميتوكوندريا متميزةمجموعات سكانية فرعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم علاج الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وفقا الصارم لبروتوكول (N08001CVsr) التي وافق عليها دو مركز HOSPITALIER DE L'جامعة مونتريال (CRCHUM) لجنة مركز البحوث المؤسسية لحماية الحيوانات التي تتبع المعايير الوطنية كما حددها الكندية مجلس رعاية الحيوان (CCAC).
إعداد جميع الكواشف اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول (الجدول 1). جميع التفاصيل الأخرى المتعلقة المعدات والإمدادات والموردين يمكن العثور عليها في قائمة المواد.
الجدول 1. العازلة التراكيب.
1. مجموعة من الفئران الحبل الشوكي
- بعمق تخدير الفئران (سبراغ داولي) مع 4٪ isoflorane. تحقق تخدير بسبب نقص المنعكس على معسر من عشرالبريد forepaw. الموت ببطء الفئران عن طريق قطع الرأس عن طريق المقصلة. ويفضل هذه الطريقة من القتل الرحيم على الآخرين، والتي قد تشوه النخاع الشوكي.
- قطع الجلد من الجزء الخلفي لفضح العمود الفقري. قطع العمود الفقري مع مقص العظام فقط فوق عظم الحوض. تصور افتتاح العمود الفقري.
- إدراج حقنة 10 مل، مع ماصة غيض 200 ميكرولتر (مرفق عبر ذوبان قليلا على لهب)، مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، في العمود الفقري.
- طرد الحبل الشوكي من خلال تطبيق كمية متوسطة من الضغط على المكبس.
- إذا أي دم موجود على الحبل الشوكي، وشطف مع برنامج تلفزيوني قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: تم أيضا التحقق من صحة هذه الطريقة لالدماغ والكبد. إذا بما في ذلك هذه الأنسجة، وجمع نصف الدماغ من الفئران الموت الرحيم وقطعة من الكبد على قدم المساواة في الوزن إلى الحبل الشوكي. تظل جميع خطوات أخرى مماثلة.
2. عزل الحبل الشوكي ميتochondria (مقتبس من فاند فيلد وآخرون. 4)
- جمع الحبل الشوكي سليمة كله ومكان في 5 مل زجاج الخالط مع 5 مجلدات (~ 3.25 مل) التجانس العازلة (HB). لاسترداد الأمثل للالميتوكوندريا المعزولة، تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو في غرفة باردة. التجانس الأنسجة باليد حتى لا تظل قطع كبيرة من الأنسجة، ما يقرب من ثمانية السكتات الدماغية. ضع جناسة في اثنين (2 مل) أو ثلاثة (1.7 مل) أنابيب microcentrifuge. الطرد المركزي 1،300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في microcentrifuge الفوق.
- استعادة طاف ومكان في أنبوب نابذة فائقة السرعة 5 مل. إضافة 750 ميكرولتر (~ 0.5 مجلدات) HB إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على بيليه و resuspend بلطف بيليه. كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق الخطوات مرتين أخريين. تجمع كل supernatants (S1A وS1B) في نفس نابذة فائقة السرعة 5 مل أنبوب أعلاه. تخدم هذه الخطوة لإزالة الحطام صغيرة.
- تجميع أجهزة الطرد المركزي S1 باستخدام نابذة فائقة السرعة مجهزة تعفن الدلو المتأرجحأو والطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إبقاء طاف (S2) لمزيد من المعالجة إذا كان جزء عصاري خلوي هو من مصلحة (على سبيل المثال لتحليل لطخة غربية). resuspend الكرية (P2)، وجزء الميتوكوندريا الخام، في 4 مل HB + 50 ملي بوكل. الطرد المركزي 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح. تجاهل طاف و resuspend بلطف بيليه (P3) في 800 ميكرولتر HB.
يتم غسلها الميتوكوندريا مع HB + 50 ملي بوكل لإزالة أي ملوثات غير محددة المرتبطة mitochondrially: ملاحظة. - في 5 مل أنبوب جديد نابذة فائقة السرعة، إضافة بالضبط 800 ميكرولتر من بيليه معلق (P3).
- لهذا الأنبوب إضافة 200 ميكرولتر من Iodixanol (التدرج الكثافة المتوسطة)، وبالتالي خلق تركيز النهائي من 12٪ Iodixanol. خلط محتويات الأنبوب بلطف، ولكن بدقة عبر pipetting لمع P1000. إضافة Iodixanol أولا، ومن ثم بيليه معلق (P3) قد يكون من الأفضل لتسهيل خلط دقيق. أجهزة الطرد المركزي في ULTracentrifuge مجهزة يتأرجح دلو الدوار في 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- ملاحظة: الكبد لا يحتوي على المايلين وبالتالي هذه الخطوة ليست ضرورية إذا كان يتم تجهيزها إلا الكبد. ومع ذلك، إذا يتم معالجة الكبد بالتزامن مع الميتوكوندريا CNS، فمن المستحسن لعلاج جميع الأنسجة بالتساوي.
- نضح طبقة المايلين في الجزء العلوي من الأنبوب وإزالة بعناية وتجاهل طاف. بيليه قد تكون فضفاضة. Resuspend وبيليه في 4 مل HB. الطرد المركزي مرة أخرى في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 4 مل HB. تكرار الطرد المركزي وإزالة طاف.
- resuspend الكرية النهائي (P7) في 100-200 ميكرولتر HB ونقل إلى أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج. تحتوي هذه العينة الميتوكوندريا المعزولة.
- انتقل إلى البروتين الكمي. تمييع عينات والمنحنى القياسي في 2٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) لضمان ذوبان كافية من الميتوكوندريا الدورينانوغرام البروتين الكمي.
3. Immunolabeling من الميتوكوندريا المعزولة عن التدفق الخلوي
- لكل مزيج تلطيخ لفحصها، ماصة 25 ميكروغرام من الميتوكوندريا المعزولة في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج. تشمل عينة غير ملوثين في كل تجربة. ولكل الأجسام المضادة، تأكد من تضمين عينة لisotype السيطرة المناسبة.
- الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية في microcentrifuge مقعد بين كبار.
- إزالة طاف و resuspend الميتوكوندريا المعزولة في 50 ميكرولتر الميتوكوندريا العازلة (M الاحتياطي) تستكمل مع 10٪ الدهنية حمض BSA مجانا لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية (الخطوة حجب).
ملاحظة: أثناء وضع العلامات، وأداء حضانات في الثلاجة على 4 درجات مئوية. - إضافة الأجسام المضادة الأولية (أرنب المضادة للMfn2، 20 ميكروغرام لكل مل) في أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تحديد تركيز الأمثل لكل الأجسام المضادة تجريبيا بواسطة المعايرة. بسبب التباين في تركيز و / أو صurity، والكثير مختلفة من نفس الأجسام المضادة من نفس الشركة المصنعة قد يؤدي إلى نتائج مختلفة؛ وبالتالي هناك حاجة المعايرة لكل دفعة جديدة من الأجسام المضادة. - تغسل الأجسام المضادة الأولية غير منضم: الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بلطف بيليه في 200 ميكرولتر M العازلة. الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر M العازلة.
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية (حمار المضادة للأرنب مفتش فيكوإيريترين (PE)، و 0.5 ميكروغرام لكل مل) في أنبوب واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
- تغسل الضد الثانوية غير منضم: الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر M العازلة. الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر M العازلة.
- لضمان الأحداث في الميتوكوندريا الواقع، وصمة عار عزل الميتوكوندريا معالميتوكوندريا صبغة الفلورسنت معين لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء. إذا كان المطلوب من المعلمات تلطيخ الفنية الأخرى (إمكانات عبر الغشاء الميتوكوندريا أو إنتاج الفائق)، انتقل إلى الخطوة 4. إذا لم يكن كذلك، انتقل إلى الخطوة 5 لاكتساب.
ملاحظة: من المهم التحقق من أن طيف الانبعاث من الأجسام المضادة الثانوية متوافق مع أن من الأصباغ وظيفية. على سبيل المثال، إذا التحقق من نقاء الميتوكوندريا مع صبغة تجارية مع الخصائص الطيفية مماثلة لإمكانات FITC والغشاء مع Tetramethylrhodamine استر الميثيل (TMRM)، والضد الثانوية قابلة للحياة سيتم allophycocyanin (APC: تحويلة 650 نانومتر / إم 660 نانومتر). إضافة ضوابط التعويضات، أي عينة immunolabeled أو الملون مع fluorophore واحد، عندما المعمول به. - نقل إلى أنبوب مناسبة لتدفق تحميل عداد الكريات. (لتسهيل صغر حجم العينة، يتم وضع أنبوب داخل عيار مكروي 3 مل تدفق عداد الكريات الأنبوب.) حافظ على عينات الجليد والشروع فوراتدفق عداد الكريات لاكتساب.
4. يعاير عبر الغشاء الميتوكوندريا الميتوكوندريا المحتملة وفوق الأكسيد الإنتاج عن طريق التدفق الخلوي
- تحقق من أن الميتوكوندريا المعزولة لديها إمكانات عبر الغشاء سليمة بواسطة تلطيخ مع 100 نانومتر TMRM (تحويلة 548 نانومتر / إم 574 نانومتر) 5، في خطوة 3.8، لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء. للمقارنة بين إمكانات عبر الغشاء بين العينات والسكان، واستخدام تركيزات أقل / تبريد غير TMRM من (1 إلى 30 نانومتر)، قد يكون أكثر ملاءمة 6.
- كعنصر تحكم لTMRM تلطيخ، وصمة عار الميتوكوندريا المعزولة مع 100 نانومتر TMRM بحضور 100 ميكرومتر الكربونيل السيانيد م كلورو فينيل الهيدرازين (CCCP)، وuncoupler الميتوكوندريا التي سوف يزيل الاستقطاب الميتوكوندريا. تركيز CCCP المطلوبة ليزيل الاستقطاب الميتوكوندريا قد تكون أقل في حالة استخدام تركيزات أقل من الصبغة.
- تحقق من أن الميتوكوندريا المعزولة تنتج الفائق الميتوكوندريا بواسطة الحاديaining مع مؤشر مناسب الفائق الميتوكوندريا 7، كما في الخطوة 3.8، لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء.
- كعنصر تحكم لإنتاج الفائق الميتوكوندريا، وصمة عار الميتوكوندريا المعزولة مع صبغة بحضور 10 ميكرومتر Antimycin A، مثبط لمجمع الثالث من السلسلة التنفسية التي من شأنها زيادة الانتاج الفائق الميتوكوندريا.
5. اقتناء وتحليل Immunolabeled الميتوكوندريا المعزولة بواسطة التدفق الخلوي
- تعيين الأداة حتى: تحويل الفولتية من الخطية إلى وضع تسجيل لتسهيل تحليل الميتوكوندريا المعزولة وتحديد الفولتية (FSC: 450، SSC: 250). ضمان أن يتم جمع الأحداث في FSC-A (منطقة) واسطة وكذلك FSC-W (العرض) وFSC-H (الارتفاع)، لتكون قادرة على استبعاد الحلل (أي حدثين، مرورا كشف في نفس الوقت ) في جمع ما بعد تحليل البيانات. تعيين عدد من الفعاليات التي سيتم جمعها إلى 100،000. اكتساب ضوابط التعويض، إن وجدت.
- الحصول على البيانات: قبل الحصول على البيانات، وتجنب vortexing لعينات. مزيج بدلا من التنصت بلطف أنبوب. في البداية جمع الأحداث عند ضغط منخفض، خلال النابضة. البوابة على مجموع السكان. ضبط الفولتية من رسوم بيانية وفقا لذلك، عادة ذروة العينة غير ملوثين سوف تتوافق مع العقد الثاني (10 2). مرة واحدة يتم إنشاء البوابات، ويتم معالجتها العينات، يمكن أن تحول الضغط إلى الأعلى.
- تحليل: تصور الحلل بواسطة بالتآمر FSC-W مقابل FSC. تحديد singlets والحلل. البوابة على singlets. تحديد السكان الميتوكوندريا المعزولة من قبل على الأحداث التي يتم الملون بشكل إيجابي مع صبغ الميتوكوندريا انتقائية.
- تحديد وضع العلامات الخلفية من isotype السيطرة. باستخدام عينة isotype السيطرة، وتحديد النسبة المئوية للسكان الميتوكوندريا وضع العلامات الإيجابية لMfn2 الأجسام المضادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الميتوكوندريا المستمدة من الفئران النخاع الشوكي يمكن immunolabeled مع الأجسام المضادة التي تستهدف Mitofusin2 (Mfn2)، وهو بروتين المتورطين في الانصهار في الغشاء الخارجي للالميتوكوندريا 8. بعد العزلة ووضع العلامات مع الأجسام المضادة المحددة Mfn2 والضد الثانوية مترافق fluorescently، تتم معالجة الميتوكوندريا بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 1). وبعد الحصول على البيانات، ويتم تحليل العينات باستخدام التدفق الخلوي برامج التحليل، من خلال وضع تصور لأول مرة جميع الأحداث التي تم جمعها على قطعة نقطة (الشكل 2A). يتم التمييز الحلل وsinglets عندما يتم رسم الأحداث في FSC، عرض (W) مقابل منطقة (A) (الشكل 2B). مرة واحدة ويتم اختيار singlets، وبوابة السكان الميتوكوندريا عبر FSC / SSC (الشكل 2C)، والتحقق من عدد من الأحداث تلطيخ إيجابية لصبغ الميتوكوندريا محددة من شارك في التآمر على الرسم البياني للعينة غير ملوثين مع عينة ملطخة الميتوكوندريا، جمعية مهندسي البترولمحدَّدة صباغة. لتحديد الأحداث الميتوكوندريا، وضع بوابة عند تقاطع قمم اثنين (الشكل 2D). للتحضير الحبل الشوكي، وعادة> 90٪ من الأحداث الإيجابية لصبغ الميتوكوندريا محددة. لأنسجة أخرى مثل الكبد، ~ 98٪ من الأحداث والتسمية مع الصبغة (لا تظهر البيانات). بعد اختيار فقط الأحداث التي تسمية إيجابيا لصبغ الميتوكوندريا محددة، وتحديد وضع العلامات الخلفية مع isotype السيطرة عن طريق اختيار بوابة (Mfn2 +) يتضمن 1٪ أو أقل نمط إسوي وضع العلامات (الشكل 2E، يسار). تطبيق هذه البوابة بشكل موحد على جميع عينات المسمى مع الأجسام المضادة Mfn2 لتحديد نسبة الميتوكوندريا مع Mfn2 موجودة على غشاء الميتوكوندريا الخارجي (الشكل 2E، يمين). في هذه التجربة، و 30٪ من الميتوكوندريا المستمدة من الحبل الشوكي التسمية إيجابية لMfn2. من المهم أن نلاحظ هنا، أنه على الرغم من يعتبر Mfn2 أن يكون معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا أعرب بتواجد مطلقochondrial بروتين الغشاء الخارجي، فإنه لم كميا سابقا. وعلاوة على ذلك، فإن تحليل immunocytochemical من Mfn2 في الخلايا المستزرعة يظهر العلامات غير متجانس من الميتوكوندريا الفردية 9. ومن الممكن أيضا أن حاتمة Mfn2 كانت متوفرة نظرا لإضافة التعديلات متعدية أو بسبب التفاعلات مع نفسه أو الشركاء الآخرين ملزم. من الملاحظة، تكونت الأجسام المضادة في هذه الدراسة باستخدام الببتيد الاصطناعية إلى N-محطة (الأحماض الأمينية 38-55). هناك البديل لصق توقع من Mfn2 تفتقر أول 302 الأحماض الأمينية، وعلى الرغم من أن هذا البديل لم يتم بعد تأكيد تجريبيا (قاعدة بيانات UniProt). وهكذا، وهذا الاختبار هو قادر على الكشف عن Mfn2 تقسم بدلا من ذلك تفتقر إلى تسلسل N-المحطة، نظرا الأجسام المضادة المستخدمة.
إمكانات عبر الغشاء الميتوكوندريا (ΔΨ م) والإنتاج الفائق يمكن تقييمها في هذا الاختبار. عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية، هناك فصل تهمة WHICH يدفع إنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية. TMRM هو صبغ الموجبة التي تتراكم داخل الميتوكوندريا في غشاء المحتملة بطريقة تعتمد 5، وبالتالي يمكن استخدامها كمراسلة من إمكانات عبر الغشاء الميتوكوندريا. غالبية الميتوكوندريا (95٪) هي TMRM إيجابية بعد تلطيخ، مقارنة بالكنترول غير ملوثين (الشكل 3A). ومع ذلك، عندما يتم إضافة CCCP uncoupler هناك انخفاض ملحوظ في عدد الميتوكوندريا قادرة على الاحتفاظ TMRM (الشكل 3A). CCCP تسمح بحرية مرور الأيونات عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وتدمير أساسا الفصل بين المسؤول وإزالة إستقطاب الغشاء.
الميتوكوندريا الافراج الفائق كمنتج ثانوي طبيعي من الفسفرة من أنا معقدة والثالث من سلسلة نقل الإلكترون. ويمكن قياس الفائق الميتوكوندريا عبر صبغة نفاذية الغشاء الذي يستهدف إلى الميتوكوندريا ويصبح الفلورسنت اتباعهالجناح تفاعل مع الفائق 7. الميتوكوندريا وظيفية تنتج كمية القاعدية من الفائق مقارنة عينات غير ملوثين (الشكل 3B). إضافة المانع مجمع III Antimycin وينتج زيادة في الفائق، كما يراها تحولا نحو اليمين في الإزهار وعدد أكبر من الميتوكوندريا (عادة ~ 10٪) التي هي الفلورسنت مع هذا الميتوكوندريا الفائق مؤشر صبغ (الشكل 3B).
الرقم 1. تخطيطي من العزلة، immunolabeling وتحليل الميتوكوندريا. خطوة 1: جمع الأنسجة والتجانس الخطوة 2: يحتوي الإجراء العزلة ثماني خطوات الطرد المركزي. المايلين، تتم إزالة احتواء رئيسيا من نسيج الجهاز العصبي المركزي عن طريق تمييع الميتوكوندريا في Iodixanol (التدرج الكثافة المتوسطة) وcentrifuging، مما أدى إلى المايلين العائمة إلى أعلى الأنبوب، بينما مكعبات الميتوكوندريا الخطوة 3: بعد العزلة والكمي، يتم حظر الميتوكوندريا، وصفت مع الأجسام المضادة الأولية وغسلها. يضاف بعد ذلك والضد الثانوية مترافق إلى fluorophore. يغسل الأجسام المضادة غير منضم إلى الخطوة 4: عند هذه النقطة الأصباغ الفلورية التي تكتب عن نقاء الميتوكوندريا، أو وظيفة الميتوكوندريا يمكن إضافة خطوة 5: الميتوكوندريا هي الآن جاهزة ليتم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي.
الشكل 2. استراتيجية لتحليل الميتوكوندريا المعزولة من قبل التدفق الخلوي. يجب أن يعدل إلى الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الفولتية للأحداث الصغيرة، باستخدام كل المعلمات في وضع لوغاريتمي. عرض FSC يجب أن يكون (FSC-W) البياناتجمعت لاستبعاد الحلل. ملاحظة، على معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي، الإعداد الافتراضي لFSC وSSC هو وضع خطي. (A) تصور جميع الأحداث التي تم جمعها على قطعة نقطة. (B) الحلل، وهما الميتوكوندريا مرورا الليزر في نفس الوقت، يمكن تمييزها عن singlets بواسطة بالتآمر FSC مقابل FSC-W (النظام الخطي). يتم استبعاد الأحداث إذا كانت قيمة FSC-W هو أكثر من ضعف متوسط القيمة FSC-W غالبية الأحداث، أي تلك التي هي جزء من سحابة كثيفة. هي بوابات الأحداث تحت هذه العتبة وsinglets. (C) مرة أخرى، تصور الأحداث في مؤامرة نقطة، وبوابة على الأحداث المتبقية. (D) رسم بياني لعينة غير ملوثين (الصلبة والرمادي، وشغل) وعينة ملطخة صبغة محددة الميتوكوندريا (MSD: الصلبة والأخضر). بوابة الأحداث تلطيخ إيجابية لMSD (MSD +). (E) الرسم البياني للisotype السيطرة، أرنب مفتش (بدد، أسود) وMfn2 عينة المسمى (الصلبة والوردي).تعيين البوابة بحيث تدر ≤ 1٪ Mfn2 + على قمة isotype السيطرة وتطبيق هذه البوابة لنفس العينة التجريبية لتحديد النسبة المئوية للأحداث وصفها إيجابية لMfn2 (Mfn2 +). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. يعاير عبر الغشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨ م) والفائق الإنتاج في الميتوكوندريا المعزولة من قبل التدفق الخلوي. (A) في ظل الظروف القاعدية وجميع الميتوكوندريا نشطة التسمية مع TMRM (الصلبة، الأسود)، مقارنة مع السيطرة غير ملوثين (الصلبة، والرمادي، وشغل) لأن صبغ يتراكم في الميتوكوندريا مع إمكانات عبر الغشاء. عدي نشوئها من CCCP protonophore (متقطع، الأزرق) تبدد إمكانات عبر الغشاء تسبب في الميتوكوندريا ليزيل الاستقطاب والاحتفاظ صبغ أقل مقارنة مع الظروف القاعدية. وتفيد التقارير البيانات مثل دلتا يعني كثافة الفلورسنت (ΔMFI)، وهو متوسط كثافة الفلورسنت من السيطرة غير ملوثين تطرح من شدة الفلورسنت متوسط العينة (B) في ظل الظروف القاعدية، الميتوكوندريا الفائق تنتج كناتج المنتج من الأكسدة الفسفرة. هذا المصدر من الميتوكوندريا الفائق يمكن يعاير مع مؤشر الفائق الميتوكوندريا، (MitoO 2-: صلب أسود اللون) مقارنة مع السيطرة غير ملوثين (الصلبة، والرمادي، وشغل). إضافة المانع مجمع الثالث، Antimycin ألف (متقطع والبرتقالي) النتائج في زيادة الإنتاج الفائق، مقارنة مع المستويات القاعدية. وتفيد التقارير البيانات كنسبة مئوية من خلايا تلطيخ إيجابية للمؤشر MitoO 2-.ك "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومن الواضح بشكل متزايد أن الميتوكوندريا هي اللاعبين الرئيسيين في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض العادي. بينما immunoblotting يمكن تحديد البروتينات التي توجد داخل الميتوكوندريا أو على سطح الميتوكوندريا في حالة معينة، وهذه الطريقة تقارير في المتوسط من مجموع السكان. هذه الطريقة لا يمكن أن تسفر عن معلومات حول وفرة نسبية من الميتوكوندريا مجموعات سكانية فرعية أو مجموعات فرعية. في حين كان من المفترض سابقا أن يتم إنشاء الميتوكوندريا جميع على قدم المساواة، في الميدان وتدرك بشكل متزايد أن الميتوكوندريا داخل الخلية يكون التباين واسعة من حيث التشكل و / أو وظيفة 10.
نهج المجهري الفلورسنت لا تأخذ في الاعتبار عدم التجانس من الميتوكوندريا. ومع ذلك، الكمي لهذا النوع من البيانات عمالة كثيفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج هو أكثر ملاءمة للدراسات باستخدام الخلايا المستزرعة، ووضع العلامات الميتوكوندريا في الجسم الحي / في الموقع صعب بسبب excesعدد SIVE الميتوكوندريا الحالية، مما يجعل التفريق بين العضيات الفردية صعبة بطبيعتها. في معظم البروتوكولات مناعية، كما أنه ليس من الممكن تسمية في وقت واحد بروتينات غشاء الميتوكوندريا الخارجي وتقييم وظيفة الميتوكوندريا بسبب الخطوة permeabilization الخلوية اللازمة لوضع العلامات الأجسام المضادة. يعمل الأسلوب الحالي مع الميتوكوندريا المعزولة، وبالتالي لا يتطلب خطوة permeabilization. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التصور الميتوكوندريا الفردية لا يمكن تحقيقه إلا عن طريق المجهر الإلكتروني، وهي ليست قابلة للتحليل وظيفة الميتوكوندريا. ومع ذلك، فإننا ندرك أن عزل الميتوكوندريا من الأنسجة يؤدي إلى تعطل شبكة الميتوكوندريا، وهذا يمكن أن تؤثر بعض عناصر ظيفة الميتوكوندريا. ومع ذلك، لا تزال هناك مقارنات بين الجوانب الفنية من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة التي تتم معالجتها على نحو مماثل صالحة.
هذا الأسلوب من immunolabeling من isolat المستمدة من الأنسجةإد الميتوكوندريا وتحليلها لاحقا من قبل التدفق الخلوي يسمح لطريقة سريعة وقابلة للقياس الكمي لكشف ورصد وجود البروتين الموجود في الغشاء الخارجي. الكشف عن البروتين وفيرة للغاية الميتوكوندريا (مثل Mfn2) هو ممكن مع هذه التقنية. وبالمثل، يمكن لهذا الأسلوب الكشف عن البروتينات وفرة المنخفضة التي تترسب فقط على غشاء الميتوكوندريا في المرض، مثل SOD1 تتجمع في سياق التصلب الضموري العضلي الجانبي (ALS) 11. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن يكون مفيدا لرصد البروتينات التي تربط عابر مع سطح الميتوكوندريا كجزء من وظيفتها الطبيعية. وتشمل الأمثلة المتصلة Dynamin البروتين 1 (Drp1)، وهو بروتين عصاري خلوي أن يتم تجنيده إلى الميتوكوندريا لتعزيز الانشطار الميتوكوندريا 12 وعامل نخر الورم المرتبط مستقبلات عامل 6 (TRAF6)، والتي translocates إلى الميتوكوندريا لزيادة أنواع الاكسجين التفاعلية الميتوكوندريا و جزء من الاستجابة المناعية الفطرية 13.
في الوقت الحاضر هذا الأسلوب هو فقط قابلة للبروتينات الموجودة على سطح الميتوكوندريا، كما permeabilization بروتوكولات قياسية لوضع العلامات الخلايا تتطلب المنظفات أن يعطل السلامة الهيكلية من الميتوكوندريا. بينما حوكم عدد من الكواشف المحتملة (غير منشورة)، لا تزال تحتاج إلى مزيد من التحسين من بروتوكول immunolabeling لجعل هذا البروتوكول قابلة للكشف عن مكونات داخل الميتوكوندريا.
هذه التقنية لها تطبيقات واسعة، ويمكن استخدامها للكشف عن وجود أو توظيف واحد أو أكثر من البروتينات إلى الميتوكوندريا تحت نماذج تجريبية مختلفة. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا يمكن أن يشترك المسمى مع اثنين من الأجسام المضادة المختلفة، وكذلك مع مؤشرات الفلورسنت 11. ويمكن أيضا أن يدرج تحقيقات الفلورسنت أخرى لوصف الجوانب الإضافية في وظيفة الميتوكوندريا. على سبيل المثال، والأصباغ المتاحة تجاريا لمراقبة الميتوكوندريا درجة الحموضة 14 15، ومستويات ATP 16 ممكنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر لوري وسارة Destroismaisons بيرار للدعم التقني المتميز وDr.Alexandre برات للوصول إلى تدفق عداد الكريات. ونود أيضا أن نعترف الدكتور تيموثي ميلر لمساهمته بشأن إزالة المايلين من التحضيرات. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث (CIHR) الشراكة الصحة العضلية بحوث، المؤسسة الكندية للإبداع، جمعية ALS كندا، ومؤسسة فريك للبحوث ALS، مؤسسة CHUM وFONDS دي لا سانتيه بحوث في كيبيك (CVV). كلا CVV وNA هم علماء البحوث في FONDS للبحوث أون سانتيه كيبيك وCIHR المحققون جديد. ويدعم SP من قبل تيم نويل Studentship من جمعية ALS كندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H.
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
