Immunodetektion af ydre membranproteiner ved flowcytometri Isoleret Mitokondrier
Summary
Beskrevet her er en metode til at påvise og kvantificere mitokondriske ydre membranproteiner ved immunolabeling mitokondrier isoleret fra gnaver væv og analyse ved flowcytometri. Denne fremgangsmåde kan udvides til at vurdere funktionelle aspekter af mitokondrielle subpopulationer.
Abstract
Metoder til at påvise og overvåge mitokondriske ydre membran protein komponenter i animalsk væv er af afgørende betydning for at studere mitokondrie fysiologi og patofysiologien. Denne protokol beskriver en teknik, hvor mitokondrier isoleret fra gnaver væv immunolabeled og analyseret ved flowcytometri. Mitokondrier isoleret fra gnavere rygmarv og underkastes en hurtig berigelse trin for at fjerne myelin en større forurenende stof i mitokondriske fraktioner fremstillet ud fra nervevæv. Isolerede mitokondrier derefter mærket med et antistof af valg og en fluorescens-konjugeret sekundært antistof. Analyse ved flowcytometri kontrollerer den relative renhed af mitokondrie præparater ved farvning med en mitokondrie specifik farve, efterfulgt af detektion og kvantificering af immunolabeled protein. Denne teknik er hurtig, kvantificerbare og højt gennemløb, der giver mulighed for analyse af hundredtusinder af mitokondrier per prøve. Det er relevant at vurdere roman proteins på mitokondrie overflade under normale fysiologiske betingelser, samt de proteiner, der kan blive mislocalized til dette organel i patologi. Vigtigt er det, kan denne metode være koblet til fluorescerende indikatorfarvestoffer at rapportere om visse af mitokondrielle subpopulationer og er muligt for mitokondrier fra det centrale nervesystem (hjerne og rygmarv) samt leveren.
Introduction
Mitokondrier er meget dynamiske organeller, der gennemgår flere runder af fission og fusion, transporteres til steder med stor efterspørgsel efter energi og reagerer hurtigt på fysiologiske stimuli 1. Da det i stigende grad erkendes, at mitokondrier i forskellige væv, endda forskellige cellulære rum, har forskellige funktionelle profiler, er der behov for nye metoder til at identificere disse forskellige mitokondrie undergrupper.
Mikroskopi giver et middel, hvorved de enkelte mitokondrier kan visualiseres og tilstedeværelsen af et protein på eller i mitokondrier kan bestemmes ved hjælp af immunfluorescens 2. Imidlertid kvantitativ analyse ved denne fremgangsmåde er arbejdskrævende og er mere egnet til forsøg med udødeliggjorte eller primære cellelinjer. Studiet af individuelle mitokondrier stammer fra væv er betydeligt vanskeligere og de fleste metoder ikke giver mulighed for nem identifikation af mitokondrie delmængder takt med stillingtagen tilation af mitokondriefunktionen 3.
For at imødegå denne forhindring, en ny metode til at immunolabel mitokondrier isoleret fra gnaver væv og efterfølgende analyseret ved flowcytometri er blevet udviklet. Dette giver mulighed for hurtig påvisning og kvantificering af proteiner lokaliseret til den mitokondriske ydre membran, som i forhold til analyse ved mikroskopi, er langt mindre arbejdskrævende og tillader analyse af tusinder af mitokondrier i en enkelt prøve. Dette assay kan anvendes til at overvåge skæbnen og relative mængde af mitochondriale ydre membranproteiner, der menes at være konstitutivt til stede i mitochondrier, rekruttering af proteiner til det mitokondrielle overflade eller påvisning af proteiner mislocalized til mitokondrierne i patologiske tilstande. Desuden inkorporering af konventionelle fluorescerende indikatorfarvestoffer tillader samtidig vurdering af visse aspekter af mitokondriefunktion i særskilte mitokondriesubpopulationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det bliver stadig mere tydeligt, at mitokondrier er vigtige aktører i både normale fysiologi og sygdom. Mens immunoblotting kan bestemme, hvilke proteiner findes i mitokondrier eller på mitokondrie overflade i en bestemt tilstand, denne metode rapporter om gennemsnittet af hele befolkningen. Denne metode kan ikke give oplysninger om relative mængder af mitokondrie delpopulationer eller undergrupper. Selv om det tidligere har været antaget, at alle mitokondrier er skabt lige, er det område, i stigende grad erkendes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Laurie Destroismaisons og Sarah Peyrard for fremragende teknisk support og Dr.Alexandre Prat for adgang til flowcytometret. Vi vil også gerne anerkende Dr. Timothy Miller for hans bidrag om fjernelse af myelin fra forberedelserne. Dette arbejde blev støttet af de canadiske Institutes of Health Research (CIHR) Neuromuskulær Research Partnership, canadisk Foundation for Innovation, ALS Society of Canada, Frick Foundation for ALS Research, CHUM Foundation og Fonds de la Recherche en Santé du Quebec (CVV). Både CVV og NA er Forskning Lærde af Fonds de la Recherche en Santé du Quebec og CIHR nye undersøgere. SP er støttet af Tim Noël Studentship fra ALS Society of Canada.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
