该协议的目的是优化建设和组织芯片质量的生物标志物的研究。它包括规划设计,数字化病理学,虚拟幻灯片注释,并自动组织排列的各个方面。
生物标志物的研究依赖于组织微阵列(TMA)。 TMA被由小组织核心重复传输从“供体”块变成了'收件人'块制作,然后用于各种生物标志物的应用。传统的TMA建设是劳动密集型的,不精确的和耗时的。在这里,使用新一代的组织微阵列的协议(ngTMA)概述。 ngTMA是基于TMA的规划和设计,数字病理学和自动组织microarraying。该协议使用134转移性结直肠癌患者的一个例子示出。组织学,统计和后勤方面考虑,如组织型,特定组织区域,并且以包括在TMA,组织斑点,样本大小,统计分析的TMA的份数,及许多细胞类型。组织学幻灯片每个病人进行扫描并上传到一个基于网络的数字化平台。在那里,他们被认为与安otated(标记),使用0.6-2.0毫米直径的工具,用不同的颜色来区分组织区域多次。供体块和12'收件人'块装入仪器。数字切片检索和匹配供体块的图像。注解区域的重复排列,自动执行产生一个ngTMA。在这个例子中,6 ngTMAs计划包含六个不同的组织类型/组织区域。两个副本ngTMAs的期望。三到四个滑动针对每个患者进行扫描; 3扫描运行是必要的,在一夜之间完成。所有的幻灯片都注明;不同的颜色来代表不同组织/区域,即肿瘤中心,侵袭前,肿瘤/基质,淋巴结转移,肝转移,与正常组织。 17注释/箱制成;时间标注为2-3分钟/箱。 12 ngTMAs生产含4,556点。排列时间为15-20小时。由于它的精度,灵活性和速度,ngTMA是一个功能强大工具,进一步提高组织芯片质量应用于临床和转化研究。
在过去的二十年中,组织微阵列(的TMA)已对生物标志物的调查研究的显着影响。的TMA基本上由重复传送的小组织核心,通常为0.6〜2.0mm的大小范围在直径制备的组织“档案”,从石蜡包埋的“供体”的块为一个单一的TMA“收件人”块( 图1)1。用一个小的核心面积,约500种不同的组织点从几个或许多不同的患者可排列为一个TMA 2。
用于预后或预测的生物标志物的研究中使用的TMA的具有很多优点。请看例子,其中的蛋白质生物标志物免疫组化法对表达对450名患者进行评估。而不是执行在450患者玻片从块的相同数目切片450免疫组化染色,从每个样品中的小核可以被排列到一个单个T马块。即使多个内核,从每个个体患者服用,块的最小数目被生产。这具有大大减少成本和其他资源,以及减少组织消耗的相当大的效果。使用大量组织的另外这允许适当地供电的研究,以在相同实验条件下进行评价。
的TMA具有许多不同的应用。例如,它们可以被用来研究形态,蛋白质表达,RNA表达和染色后用不同的染料DNA畸变,或免疫组织化学或发色,甚至荧光原位杂交3-7之后。最近的研究还利用组织芯片检测的染色方法和内部实验室间的差异,建立特异性抗体或特定基因突变的敏感度,并确定蛋白表达在国际合作的观察者间的重复性<suP> 8-11。
传统的TMA使用来自患者的组织建设是一个长期的多步骤的过程( 图2)。它从一个寻找可能的适当情况下并选择从档案诊断幻灯片在病理学研究所,或其他机构,从那里他们被检索。病理学家评估每个个案每张幻灯片,并选择最有代表性的幻灯片研究的目的。接着,对感兴趣区域直接使用显微镜下一支笔标记。这往往是具有挑战性和不精确而导致仅在组织中的冲头,应采取由一个“估算”。接着,对应于这些标记的幻灯片的石蜡块中检索从归档。块和滑块之间的快速对比。使用半自动化或自制的组织阵列中,供体块被冲压出在感兴趣的估计区域,并转移到受体TMA块。组织芯片采用这种排列方法的施工劳动强度大,费时,不精确和不灵活。准备475斑点TMA 3份,估计需要约84个小时的工作。
规划设计(或咨询),数字病理结合专业知识,组织学和自动化TMA排列12:一种新的方法来组织芯片的构建近日由病理学研究所,伯尔尼大学,依靠三个组件介绍。总之,这个概念被称为新一代的组织微阵列(ngTMA)。下面,一个协议,用于ngTMA是基于对134例转移性大肠癌的一例进行说明。这里,原发肿瘤以及淋巴结转移和肝转移要被排列成ngTMAs用于随后的生物标志物分析。此外,从每个病人的小组织芯被期望为未来的核酸提取。
在本文中,协议ngTMA概述。 ngTMA是一家新成立的概念,涉及到规划,设计,数字病理学和幻灯片注释组织microarraying以及自动组织microarraying 12。
相比传统的组织microarraying,ngTMA提供了许多优势。在第一步骤中,规划和设计阶段是关键的。重点是回答有针对性的研究问题。这应该考虑到组织问题( 例如 ,有多少点我想要的区域,包括?),统计规划( 例如 ,样本量?如何后来我分析的样本?)和后勤方面的考虑( 例如 ,如何许多生物标志物,因此多少ngTMA副本?)。具体ngTMA是为特定需要做,无论是生物标志物的筛选和高通量或拟研究特定组织学方面上只有少数几个精心挑选CASES。
一,如果不是,常规组织microarraying的最重要的缺点是低精度,这在组织切片的标记制成。具体的组织结构,细胞或地区的研究,取得了几乎是不可能的。 ngTMA允许高精确度,因为注释是对数字切片直接放置。这使得研究者能够精确地选择的区域被冲切,包括特定的细胞。在这个例子中,相同的组织块内的各种区域被冲切出的排列,例如在肿瘤中心,入侵前和肿瘤/基质相互作用的区域通过的小肿瘤细胞簇,甚至单个细胞中存在突出。此准确性只能使用ngTMA实现。第三,因为载片扫描到一个基于网络的数字平台,滑动观看和注解可以通过计算机而不是用显微镜进行。组织排列软件提供了一个用户友好的可以实现具有高度的灵活性,因此不同的布局和ngTMA设计接口。由于TMA建筑用钻孔自动执行的,有需要的小的动手操纵和时间进行施工的量显著降低。在这里这个例子的时候了公会建设是24小时之间。使用常规的TMA方法,并估计每个小时15拳,这个项目大约需要304小时。
ngTMA可应用于研究蛋白质的表达,mRNA或DNA,以及它们的组合, 图9示出几个这样的应用中的潜在生物标志物。标准免疫组织化学可用于确定使用Ki-67的癌症的增殖指数。的组合的方法来调查对基因如HER2蛋白表达和DNA扩增可以使用。组织可以一起聚集在一个单一的ngTMA以降低成本,组织使用和其它资源第此外, 在对HER2和其他基因原位杂交显色的mRNA可以被执行以确定在大量使用的组织切片的最小数目的情况下单个mRNA转录物。免疫标记物,如CD8 +免疫组化,可以可视化在肿瘤微环境的上下文。双免疫组织化学也可以用于突出显示感兴趣的特定区域,例如在癌症的侵袭前的免疫细胞(标记为红色)和肿瘤细胞(标记为棕色)之间的相互作用。这种利益的区域已经不能用传统的组织microarraying抓获。
然而,该协议包含了一些限制。最重要的挑战是供体块和数字幻灯片之间的重叠。有几个因素可以影响这一步。首先,从块的最新的部分应被用于幻灯片扫描。在很多情况下,H&E不是供体块,rathe的最后部R在免疫组化或其他污渍。在这种情况下,也有染色的载玻片,可以作为最后的污渍被扫描和注释的或新的H&E应作为长。当被制成组织切片的组织可以在水浴这导致滑动和块的具有挑战性的匹配扩展护理也应考虑。其次,在目前的项目仅限于在单一时间处理12收件人TMA块。必须在较大的项目超过12的TMA分配到第二个项目的名称。第三,捐助块必须使用标准的模具和磁带,仪器不能自行调节,以各种尺寸进行。最后,捐助块必须超过最低高度(4毫米),以达到最佳的钻孔。在某些情况下,这需要组织reembedding。
数以百计的出版物在过去的几年中突出的公会作为一个宝贵的工具,生物标志物的研究。的TMA已被用于研究肺13,结肠7,冰川AST 14,前列腺癌15,16胰腺,膀胱癌17,和胃的癌症18,仅举几例。越来越多的作家已经联合使用的TMA与图像分析和显著进展目前正在朝这个方向19-21。然而,少数已公布的创新意念的TMA 22-24研究小组的旁边,稍不注意被赋予了优化TMA技术本身。自动组织microarrayers,如ATA-27由Estigen /彻办提供版面设计和方便的和自动化的组织冲孔。然而这表示ngTMA概念的仅有1方面。
ngTMA是一个实质性的改进,传统的组织microarraying技术。它包含在组织学和TMA设计专长与数字化病理学的灵活性和数字标注的速度和自动化TMA建筑物可靠性的精度。 ngTM的组合A和图像分析,蛋白质和分子生物标志物的评估将是一个强大的工具来进一步提高临床和转化研究,在未来的质量。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢的转化研究单位的技术人员;玛丽Economou,何塞·加尔万,卡罗琳锤,多米尼克·穆勒,利利安Schöni和信息学团队在病理学研究所,伯尔尼大学。
Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |