Maus fötalen Leberkultursystem zur Ziel Gen-Funktionen in der frühen und späten Stadien der Klemme Erythropoese Dissect
Summary
Wir stellen ein in-vitro-Maus fötalen Leber Erythroblasten Kultursystem, das die frühen und späten Stadien der Erythropoese Anschluß seziert. Dieses System erleichtert die funktionelle Analyse von spezifischen Genen in verschiedenen Entwicklungsstadien.
Abstract
Erythropoese beinhaltet ein dynamischer Prozess, der mit engagierten Erythroid-Burst-bildende Einheiten (BFU-E), gefolgt von sich schnell teilenden erythroiden Kolonien bildenden Einheiten (CFU-E) beginnt. Nach CFU-Es sind Zellen morphologisch erkennbar und in der Regel Terminal Erythroblasten bezeichnet. Eine der Herausforderungen bei der Untersuchung der terminalen Erythropoese ist der Mangel an experimentellen Ansätzen, um Genfunktionen in chronologischer Weise zerlegen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einzigartige Strategie Genfunktionen in der frühen und späten Stadien der Erythropoese Endgerät bestimmen. In diesem System wurden Maus fötalen Leber TER119 (reifen Erythrozyten-Zellmarker) negativ Erythroblasten gereinigt und mit exogenen Expression von cDNAs oder kleine Haarnadel RNAs (shRNAs) für die Gene von Interesse transduziert. Anschließend wurden die Zellen in Medium, das außer Erythropoietin (Epo), ihre Vorläuferstufe für 12 Stunden beibehalten, während man die exogene cDNA oder shRNAs Wachstumsfaktoren kultiviertzum Ausdruck zu bringen. Die Zellen wurden auf Epo Medium nach 12 h geändert wurde, um die Zelldifferenzierung und Proliferation zu induzieren, während die exogene genetische Materialien wurden bereits angegeben. Dieses Protokoll ermöglicht Analyse der Genfunktionen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese. Zu spät Terminal Erythropoese zu untersuchen, wurden Zellen sofort in Epo Medium nach Transduktion kultiviert. Auf diese Weise wurden die Zellen bereits mit dem späten Stadium der terminalen Erythropoese unterschieden, wenn die transduzierten genetischen Materialien wurden exprimiert. Wir empfehlen eine allgemeine Anwendung dieser Strategie, die Ihnen helfen zu verstehen, detaillierte Gen-Funktionen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Terminal würde.
Introduction
Erythropoiese ist der Prozess der Differenzierung der multipotenten hämatopoetischen Stammzellen zu reifen Erythrozyten. Dieses schrittweise Verfahren umfasst die Bildung von erythroiden Bursts engagierten bildenden Einheiten (BFU-E), die sich schnell teilende erythroide Kolonien bildenden Einheiten (CFU-E) und morphologisch erkennbaren Erythroblasten 1,2. Terminal Erythropoese von CFU-E-Vorläuferzellen beinhaltet sequentielle Erythropoietin-abhängigen und unabhängigen Stufen 2,3. In der frühen Stufe der terminalen Erythropoese, Erythropoietin (Epo) bindet an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche und induziert eine Reihe von stromabwärts gelegenen Signalwege, die Apoptose zu verhindern und eine schnelle Zellteilung und Genexpression 1,4. In der späten Phase der Klemme Erythropoese, Erythroblasten unterziehen Ausfahrt Terminal Zellzyklus, Chromatin und Kern Kondensation und Extrusion der höher kondensierten Kernen 5.
Unser Verständnis von TerminalErythropoese hat sich in den letzten Jahrzehnten, die weitgehend auf die erfolgreiche Verwendung von mehreren in vitro und in-vivo-Maus-Modellen 6-9 verbessert. Unter diesen Modellen in vitro-Kultur von Maus fötale Leber Erythroblasten bietet viele Vorteile, einschließlich der einfachen Zellreinigung, schnelle Proliferation und Differenzierung, und eine engere menschliche Mimik Erythropoese 10,11. In diesem System kann eine große Anzahl von Erythrozyten-Vorläuferzellen aus der Maus fetalen Leber leicht durch den Schritt Reinigung von TER119 (ein Marker für den reifen Erythrozyten) negativ Erythroblasten isoliert werden. Während des zweitägigen Kultur der Erythroblasten, kann die Differenzierung dieser Zellen durch eine durchflusszytometrische Analyse, basierend auf Oberflächenexpression des Transferrin-Rezeptors (CD71) und dem Antigen TER119 12 überwacht werden. Zusätzlich kann Enukleation der terminal Differenzierung von Erythroblasten von einer DNA-Hersteller (Hoechst 33342) 1 erkannt werden3. Weiterhin können die gereinigten Vorläuferzellen genetisch durch exogene Expression von cDNAs oder small hairpin RNAs (shRNAs) für die Gene von Interesse, die die mechanistische Untersuchungen der Funktionen der Genexpression auf die Erythropoese 11,13,14 erleichtert modifiziert werden.
Andererseits kann die schnelle Zellwachstumsrate ein zweischneidiges Schwert, da es schwierig ist, Genfunktionen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Anschluß charakterisieren. In den meisten Fällen ist es schwierig zu bestimmen, ob ein bestimmtes Gen-Funktionen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese, da bis zum Zeitpunkt der cDNAs oder shRNAs ausgedrückt, bereits frühzeitig bestanden die Zellen. Um dieses Problem zu lösen, ein einzigartiges System, um die frühen und späten Stadien der Erythropoese Anschluß sezieren entwickelt. Für die frühe Stufe der terminalen Erythropoese, wurden genetisch modifizierte TER119 negativen Erythroblasten in Epo-freien Medium, jedoch mit Stammzellfaktor (SCF) kultiviert, IL-6 und FLT3Liganden an ihre Vorläufer Zustand zu erhalten und ermöglichen die transduzierten cDNAs oder shRNA Expressions 13. Die Zellen wurden auf Epo enthaltenden Medium nach 12 h geändert wurde, die Zellproliferation und Differenzierung zu induzieren. Auf diese Weise, wenn die Zellen begannen, zu differenzieren, die transduzierten cDNAs oder shRNAs wurden bereits angegeben. Für die späte Phase der Klemme Erythropoese waren TER119 negativen Erythroblasten in Epo haltigem Medium unmittelbar nach Transduktion kultiviert. Daher kann man die Funktionen der Gene von Interesse in der späten Phase der Klemmen Erythropoese zu analysieren. Zusammenfassend würde eine breite Anwendung dieses Systems sezieren Gen-Funktionen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Klemme zu helfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir ein einzigartiges System chronologisch analysieren Maus fötalen Leber Terminal Erythropoese. Durch die Anwendung der verschiedenen Kulturbedingungen haben wir erfolgreich seziert Terminal Erythropoese in frühen und späten Stadien. Dies ist besonders wichtig, die Mechanismen von Genen mit mehreren Funktionen zu bestimmen. Zum Beispiel spielen Rac GTPasen wichtige Rollen in verschiedenen Stadien der Erythropoese Terminal. Hemmung der Rac GTPasen in der frühen Stufe der terminalen Erythropoese Ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von NIH R00HL102154 ein American Society of Hematology Scholar Award P Ji unterstützt und.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
| holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
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