En hög halt Imaging analys för Identifiering av botulinneurotoxin hämmare

Introduction

Bakterien Clostridium botulinum producerar Botulinum-neurotoxin, ett av de mest potenta biologiska gifter som människan känner till ^1. Det finns 7 olika BoNT serotyper (BoNT / AG). BoNT / A-Gall inducerar förlamning vid den neuromuskulära förbindelsen på grund av SNARE komplexa proteolys ^2,3. SNARE proteolys förhindrar signalsubstans blåsmembranfusion och därmed blockerar exocytos av neurotransmittorer ^4. Den specifika SNARE målet beror på den speciella BoNT serotyp involverad i berusning processen. BoNT / A och BoNT / E klyver SNAP-25, medan BoNT / C klyver både SNAP-25 och syntaxin ^5. Den återstående serotyper klyver synaptobrevin (även kallad Blås-associerat membranprotein (VAMP). BoNT / A valdes för metodutveckling eftersom den är ansvarig för en stor andel av naturligt förekommande botulism och har den längsta verkningstid ^6. Utveckling av små molekyler terapier mot BoNT / A är ett viktigt mål förvår läkemedelsforskning programmet och har utnyttjat traditionella målrelaterade metoder för att identifiera aktiva site proteolytiska hämmare ^{7, 8-10.} Dock kommer skapandet av aktiva site hämmare med bredspektrumaktivitet mot flera serotyper och efter exponering effekt sannolikt vara utmanande.

Vi har därför genomfört ett innovativt, fenotypisk läkemedelsframtagning metod som använder BoNT SNAP-25 klyvning som en funktionell endpoint för att identifiera små molekyler som kan blockera BoNT-medierad motorneuron berusning. SNAP-25 krävs för frisättningen av neurotransmittorer, såsom nedbrytning av SNAP-25 är förutsägande för paralys och letalitet in vivo. Till exempel kan cellbaserad screening leda till upptäckt av nya modulatorer av cellulära faktorer som är ansvariga för toxininaktivering eller hämning av toxin vägar inne målceller. En viktig faktor i fenotypisk analys utveckling är urvalet av fysiologiskt relevanta biologiska modeller. We och andra har beskrivits mus embryostam (ES) cellhärledda motomeuroner att rekapitulera den immunologiska karaktären av primära motoriska neuroner, inklusive uttryck av SNAP-25 ^{11- 13.} Viktigt är att dessa cellulära system är mycket känsliga för BoNT / A-förgiftning och demonstrera dosberoende spjälkning av SNAP-25 som svar på ökande koncentrationer av toxin ^11,12. De differentierade motoriska nervceller produceras också i mängder som är tillräckliga för hög genomströmning platta baserad analys och tillåtet utformningen av en rad cellulära analyser.

Den fenotypiska analysen är en immunofluorescens metod som använder två olika antikroppar för att kvantifiera klyvning av endogent uttryckt fullängds SNAP-25 under BoNT / A rus av mus motorneuron kultur. En karboxylterminala BoNT / A klyvning känslig (BACS) antikropp som känner igen endast fullängds SNAP-25 gör det möjligt att bedöma BoNT / A förmedlad proteolys av SNAP-25expression i mus motomeuroner ^10. Ett schematiskt diagram av det HCl-analysen visas i Figur 1.

Protocol

Plate 20.000 differentierade mus-ES-celler (MES) / brunn i en 96-brunnars poly-D-lysin-belagda plattor och bibehålla i motorneuron terminal differentiering media för 5-7 dagar.

1. Förening Administration och Förgiftning med BoNT / A

Utför alla följande arbete i BSL2 inhägnad för att upprätthålla efterlevnaden av CDC / NIH riktlinjer.

1. Förbered 10 mM stamlösningar av varje bibliotek förening i 100% DMSO i polypropen 96-brunnars plattor. Använd 10 mM lager för att förbereda en mellanspädplatta som är 10 gånger större än den önskade screening koncentrationen. Bered 100 uM mellanliggande plattan genom att dispensera 10 mM lager i 96-brunnars platta och späd det till 100 | iM med användning av odlingsmedier. Fördela 10 pl av föreningarna på 90 pl av media på cellerna ^11. Testa föreningarna vid 10 | iM slutlig koncentration och säkerställa den slutliga procentandelen av DMSO inte överstiger 0,5%.
2. Utför alla studtalet som utnyttjar levande celler och aktivt toxin i skyddsnivå 2 villkor. Byt ut de gamla medier i de 96 brunnar med 80 pl färsk terminal differentiering media med en 12 kanals manuell pipett. Utför aspiration och fördela steg med rader för att undvika exponering av cellerna utan media till den omgivande luften.
3. Förbehandla celler med föreningar före applicering av toxinet genom tillsats av 10 ^ il 10 x föreningar från källplatta med användning av en 12-kanal pipett, följt av blandning genom aspiration (två gånger). För varje 96-brunnar, behandla två kolumner med 6 brunnar med 10x DMSO utspätt i media för att fungera som hög signal och låg kontroll signal. Kolonnen utan BoNT behandling uppvisar den högsta nivån av fullängds SNAP-25 (hög signal kontroll). Behandla andra kolumnen med BoNT ensam (utan några föreningar) som den låga signalstyrning. Använd låg kontroll för att följa effektiviteten i BoNT klyvning av SNAP-25 och dess detektion med BACS antikropp (figur 2).
4. Inkubera cellerna med föreningar för 30 min vid 37 ° C och 6% _CO2 i cellodlingsinkubator.
5. Förbered botulinumtoxin A från en 1 mg / ml kommersiell källa i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig 10x arbets lager genom att späda med terminal differentiering media.
6. Initiera berusning genom att tillsätta 10 pl 10x BoNT / Ett lager i brunnar avsedda för behandling och låg signalkontroller med hjälp av en flerkanalspipett (Figur 2). Behandla brunnarna som betecknas som hög kontroll med enbart media.
7. Sanera alla plastartiklar och andra förbrukningsvaror som kommer i kontakt med BoNT / A under studien genom nedsänkning i 0,825% hypoklorit lösning i vatten i minst 20 minuter. Utför alla förfaranden i biosäkerhet skåp och sanera arbetsområden både före och efter experiment med 5% rengöringsmedel desinfektionsmedel rengöringsmedel såsom MICROCHEM lösning.
8. Märk plattorna klart att beteckna toxin användning och incubåt plattorna behandlades med 1 nM / L BoNT / A under 4 h vid 37 ° C och 6% _CO2 i en cellodlingsinkubator. Display lämplig skyltning för att informera kollegor om att toxin används i laboratoriet.
9. Stopp BONT / A proteolytisk klyvning av metanolfixering. Ta bort media som innehåller toxin och föreningar från varje brunn med en multikanalpipett och kasta i 10% blekmedel. Lägg iskall metanol (100 | il) direkt till varje brunn.
10. Inkubera plattorna under 15 min vid rumstemperatur (RT) för att medge fixering att uppträda.
11. Efter fixering säkert sätt hantera de kasserade reagenser (ansåg neutraliserade) med biosäkerhet nivå 1 protokoll och kasta därefter.
12. Kasta metanol och använda 100 l PBS för att tvätta cellerna och återfuktar dem före immunfärgning. Genomför ytterligare två PBS tvättar.
13. Efter den slutliga tvätten, lämna PBS i brunnarna, försegla plattor med mikroplatta limfilm och förvara vid 4 ° C fram till analys. Förvara plattorna vid 4 ° C for flera dagar.

2. Immunfärgning

Den immunfärgning Förfarandet är en arbetsintensiv, flerstegsoperation som innehåller repetitiva reagensdispense / aspirera cykler och omfattande platta tvätt som kan leda till införande av potentiella betydande intraplate och interplate variabilitet. En halvautomatisk strategi tillämpas för att spara tid för laboratoriepersonal, öka analys genomströmning och minimera immunfärgning variabilitet.

1. Använd en automatiserad arbetsstation utrustad med en 96-håls huvud kan överföra volymer upp till 250 l och integreras med en robot griparm att flytta laboratorieutrustning till olika platser på modulära däck (se Material och utrustning) för detta protokoll.
   1. Modul däcket är konstruerat för att vara värd olika typer av laboratorieutrustning och kan hantera upp till 11 punkter åt gången. Den automatiserade mikro handler är utrustad med en dubbel tidskrift mikro stacker för att hålla ochmanipulera upp till 50 plåtar per cykel.
   2. Den automatiserade arbetsstationen är placerad inne i en klass II biosäkerhet skåp konstruerats för laboratorieautomation utrustning för att ge sterilitet och säkerhet. För automatiserad immunfärgning, är däcket anordnade som visas i fig 3 för att göra det möjligt för reagens tillgång efter behov och utan mänsklig inblandning.
2. Pre-belastningsplattor innehållande fixerade celler i plattan tidningen och transfer till däck som behövs för vätskehantering. Använd 96 pipetthuvud utrustad med 250 ul tips för att aspirera PBS från brunnarna ner till 10 pl. Permeabilisera cellmembran för att underlätta antikroppsbindning till intracellulära mål med permeabilization buffert (0,1% Triton-X 100). Dispensera permeabilisering buffert (100 | il) till varje brunn innan de återvänder plattorna till det andra lagringsmagasinet av mikroplattan led till en 15 min inkubation vid rumstemperatur (RT).
3. Ta permeabilization buffert och peR formplatta tvättning med PBS (två gånger) såsom beskrivits tidigare i steg 1,13.
4. Efter det sista tvättsteget, ta bort PBS-buffert och fördela 100 ul blockerande buffert innehållande 1% hästserum och 0,1% Tween 20 i PBS i alla mikro innan han återvände dem till plattan magasin för 1 timme inkubation vid RT.
5. Använd två primära antikroppar för immunfärgning: en kanin polyklonal anti-mus BACS antikropp för detektion av fullängds SNAP-25 och en mus monoklonal anti-III tubulin antikropp för detektion av neuroner (se Material och utrustning). Efter 60 minuters inkubering, avlägsna blockerande buffert och dispensera 50 | il av 4ug / ml BACS-antikropp och 0,5 ug / ml av III-tubulin i blockerande buffert i alla plattor.
6. Inkubera under 1 timme vid RT avlägsna de primära antikropparna och tvätta tre gånger med 100 | il av PBS innehållande 0,05% Tween (PBST).
7. Använda ett anti-mus-IgG märkt med Alexa Fluor 647 att visualisera -III tubulin och anti-kanin IgG-märkta med Alexa Fluor 568 att visualisera BACS antikropp. Förbered båda antikropparna som en 2 | ig / ml spädning i blockeringsbuffert och dispensera 50 | il av blandningen i varje brunn.
   OBS: De sekundära antikroppar som väljs ut för immunfärgning är märkta med olika fluoroforer för att möjliggöra detektion av deras emitterade fluorescerande ljuset vid distinkta våglängder som använder olika kanaler inom detektorn av det höga innehållet Imager.
8. Inkubera under en timme vid RT. Aspirera de sekundära antikropparna och tvätta tre gånger med 100 pl av PBST.
9. Efter den slutliga tvätten, tillsätt 100 | il av PBS innehållande Hoechst färgämne (32 | iM) för att färga DNA för kärnor detektering.
10. Täta plattor med en lätt ogenomtränglig film för att skydda fluoroforema från fotoblekning. Plattorna kan lagras vid 4   ° C i veckor utan betydande förlust av signal.

3. Imaging

OBS: Utför bildtagning med hjälp av hög Content Imaging System (se Material och utrustning).

1. Specifikation av höga innehåll Imager Definitioner:
   1. Välj tavla typ, layout, antal fält, mål: Greiner u klar, 96 bra format, 16, 20X vatten resp.
   2. Välj kanaler: nucleus excitation EX: 405 nm som kanal 4; cytoplasman EX: 644 nm som kanal 2; antigenspecifik antikropp kanal EX: 561 nm som kanal 3 och Ställ in excitation makt varje laser, Setup experiment som 2 exponeringar, Exponering 1 med en excitation vid 644 nm, Exponering 2 med två excitationer vid 405 nm och 561 nm. Välj binning som Bin2.
   3. Använd höga kontrollbrunnar för exponering optimering med maximal intensitet som SNAP-25 kanal och låga kontrollbrunnar för minimal intensitet.
   4. Justera exponeringen, så att intensiteten hos varje kanal är ungefär hälften av mättnadsnivån (2,000-2,500 relativa enheter).
   5. Identifiera den optimala Z-plan på cell mask kanal med deltakorrigering script. Se Figur 5 för resultat efter immunfärgning och bildbehandling. Exportera data till servern där bilden analysprogram är bosatt.

4. bildanalys (figur 6)

OBS: I följande steg beskrivs tillämpningen av Columbus mjukvarualgoritmer.

1. Välj en lämplig algoritm för segment de primära objekt (kärnor). Vid behov, justera bakgrundströskel och kontrastparametrar. Columbus programvara ger 4 kärnor detektionsmetoder. Välj den metod som segment kärnor exakt genom visuell inspektion segmente kärnor (i F igure 6a metod M väljs).
2. Välj neurite algoritm (CSIRO neurit Analysis 2) till segment neuriterna Vid behov justerar bakgrunds tröskel- och kontrastparametrar för att ta bort bakgrunden. Se figur 6b för parametrar som används för att upptäcka neuriter.
3. Identifiera neurite regionerna (neurite segment) Based om sekundära objekt (neuriter) med en -3 pixel expansion av β-III-tubulin kanal (Alexa Mjöl 640) som mask (Figur 6c).
4. Beräkna intensiteten av signalkanaler (SNAP-25, (Alexa Mjöl 568) för neurites regionen och β-III-tubulin-kanal (figur 6d och 6e).
5. Välj önskade parametrar för export, såsom neurite längd, genomsnittliga intensiteter av SNAP-25, β-III tubulin, kärnor nummer, neurit segmentnummer etc. (Figur 6f).
6. Överför plattor från plåt staplare med hjälp av roboten och lasten i det höga innehållet Imager för bildtagning.

5. Dataanalys:

För att bedöma robustheten i designanalys, beräkna följande parametrar från den plattbaserade experiment.

1. Signal (S) till bakgrund (B): S / B = medelintensiteten för hög signalkontroll) / medelintensitet på låg signal kontroll
<li> Variationskoefficient (CV) av signal och bakgrund (för att mäta enhetligheten hos den specifika signalen): CV = (standardavvikelse (SD) / medelvärde för urval) * 100 (%), för att bestämma variationen i vätskehantering, reagens, etc.
2. Signal brus: S = (genomsnittlig intensitet signal - medelintensiteten för låg signalkontroll) / SD med låg kontroll
   1. Beräkna Z "faktor med berusning av en halva av en 96-brunnsplatta och en mock berusning av den andra hälften. Z '= 1-3 * (SD hög signalkontroll + SD för låg signalkontroll) / (medelvärde av hög signalkontroll - medelvärde för låg signalkontroll). För ytterligare analys av screeningdata, normalisera vissa av de primära rå parametrar på en tallrik basis för att möjliggöra jämförelser mellan plattorna och mellan olika dagar i experiment.
3. Procent av klyvning, vilket återspeglar en minskning av den signal som är associerad med full längd SNAP-25 som detekteras av specifik antikropp (BACS):% Spjälkning = 100% * (MEAn intensitet hög signalkontroll - intensitet prov) / medelintensiteten för hög signalstyrning.
4. Procent Inhibering av klyvning:% inhibering = 100% * (intensitet av prov - medelintensitet på låg signalkontroll) / (medelintensiteten för hög signalkontroll - medelintensitet på låg signal kontroll).

Representative Results

Data från höga och låga kontroller skapat två distinkta populationer med skillnaden mellan två median överstigande 3 standardavvikelser (figur 7A). Målet med urvalsförfarandet är att hitta föreningar inom provpopulationen med värden närmare positiv kontrollpopulation, antar en normalfördelning i provpopulationen (Figur 7B, (i)). Datapunkter som är 3 standardavvikelser utanför medelvärdet anses statistiskt från buller och klassas som en aktiv "hit" (figur 7B (ii), röda lådor). De föreningar som klassificeras som "träffar" kommer att utsättas för ytterligare bekräftelse testning i framtida studier. Figur 7B (ii) visar detektering av positiva träffar i populationen av proverna från ett representativt delmängd av silplattorna. Alla 4 poäng som hade värden som är lägre än de (median proven - 3 * SD överensstämmelse) tillhördesamma hämmare som sågs på olika platser inom 4 olika silplattorna. Denna inhibitor visade robust SNAP-25 skydd mot BoNT / A, såsom visas i fig 5.

Figur 1: Arbetsflöde för förening screening i BoNT / A HCI-analys.

Figur 2:. Den 96-brunnar karta för HCI-analysen Hög kontrollbrunnar (rosa) behandlades med 0,5% DMSO som kontroll endast och låga kontrollbrunnar (blå) behandlades med 1 nM BoNT / A och 0,5% DMSO. Provbrunnar (grönt) behandlades med 1 nM toxin och 10 ^ M av föreningarna i 0,5% DMSO. De yttre kolumner och rader (grå) inte användas på grund av oförenlighet med den optimerade platta förmatta och oförmåga 20X vattenimmersionsobjektiv till bildkantbrunnar.

Figur 3:. Utformningen av den automatiserade arbetsstationen däck för immunofärgning assay Blockeringsbuffert, primär antikropp, sekundär antikropp och cellulära fläckar dispenserades i 96-brunnars polypropylenplattor att minska dödvolymen reagensförlust. PBS dispenserades i ett fack som kan hålla 300 ml. Fördelaren används för aspiration flytande avfall visas på den infällda bilden.

Figur 4: Skärmdump av det höga innehållet Imager experimentell inrättas.

ng> Figur 5:. Hög halt avbildning av SNAP-25 klyvning i mus-ES-härledda motomeuroner Cellerna behandlades med 1 nM BoNT / A med och utan tillsats av 1 | iM av inhibitor (Toosendanin) ¹⁴ eller lämnas obehandlad utan toxin. SNAP-25 detekterades med BACS antikropp. I en annan kanal, var nervceller upptäcktes med hjälp av en β-III-tubulin antikropp för att skapa mask av neuriter för SNAP-25 bildanalys. Detta är för en enda representativ bild från en av de 16 bilder som tagits från en given brunn. Blått anger kärnor färgas med Hoechst 33342, rött är BACS signalen och grönt är β-III-tubulin signal. Bilder erhölls med Operan som beskrivs. Storlek bar: 10 pm

Figur 6: Skärmdumpar som visar olika steg i bildanalys pipeline.

s ">
Figur 7: Statistisk visualisering av data som härrör från HCI skärmen. (A). (I) Box plot analys av% Cleavage beräknat från kontrollbrunnar; visas som medianvärde med sina respektive SD (n = 16). Rosa representerar den höga signalreglering (HSC); blå representerar den låga signalreglering (LSC). Z '= 0,97 (ii) Histogram fördelning av samma värden som i (i) för att visa avståndet mellan två kontrollpopulationer. Median och 3 SD beräknades från de statistiska värden förknippade med motsvarande box-plot. (B). Fördelning av 192 föreningen behandlade prover från samma experiment. (I) Box-plot som visar det statistiska värdet för% klyvning för prov i jämförelse med kontroller samt statistiskt signifikanta extremvärden. (Ii) och (iii), Histogram fördelning av samma värden i populationen av all data från skärmen (grönfärg). Hits (markerade med röd fyrkant), valdes ut från de extremvärden som har% klyvning värden mindre än 3SD från medianen av prov befolkningen (<25.89% klyvning). De fyra träffar markeras under valet (iii) på histogrammet för alla datapunkter har liknande värden till den höga signalreglering och representerade samma förening, spetsade i plattan för testerna, en känd BoNT / A hämmare (Toosendanin) som blocke SNAP -25 klyvning.

Discussion

Den höga styrkan hos botulinneurotoxiner och relativt lätt att deras beväpning har resulterat i att dessa klassificeras som kategori A (högsta prioritet) biothreat agenter av amerikanska Centers for Disease Control and Prevention. Tyvärr finns det inga FDA godkända läkemedel för att motverka BoNT berusning efter toxinet har internaliseras av motoriska nervceller. Alla druggable mekanism som främjar neuronal återhämtning från BoNT berusning kan leda mot utvecklingen av en potentiell behandling för att skydda både försvarsmakten och allmänheten mot denna biologiska hot. I den här artikeln presenterar vi en detaljerad HCI analysprotokoll för screening hämmare av dödliga gifter som BoNT / A. En ovanlig aspekt av denna analys är noggrann lämnandet av gifter och att strikta biosäkerhet protokoll för att garantera laboratoriesäkerhet. Extrem försiktighet måste iakttas när aktivt toxin används. BoNT / A inaktive via metanolfixering och mikro decontaminatipå med 10% blekmedel och 5% ytrengöringsservetterna är viktiga steg som gör att mikroplattor tas bort från biosäkerhet skåp för nedströms utvärdering skyddsnivå 2 labbmiljöer.

På grund av den ständigt växande storleken av substansbibliotek i kombination med långsam motorneuron expansion (antal celler), MDI analyser för neurotoxin antagonister tenderar att köra över flera veckor. Detta kräver att variabiliteten mellan plattorna och över tid måste elimineras eller minimeras. I detta protokoll ger vi automationsmetoder för immunfärgning, bildtagning och analys för att minska analysvariationer. Ytterligare tillförlitlighet och enhetlighet kan uppnås genom automatisering av rutinuppgifter i samband med detta protokoll, inklusive cell plätering, tvättning och fixering. Vår grupp utvärderar för närvarande effekterna av dessa förbättringar med avsikt att införliva dem i våra protokoll inom en snar framtid.

I denna rapport beskriver vi en SNAP-25klyvningsanalys med användning av hög halt imaging att mäta relativ fluorescens av intakt SNAP-25 i motoriska nervceller. Denna analys använder BACS och β-III-tubulin-antikroppar för att detektera fullängds SNAP-25 och β-III tubulin respektive ^11. β-III-tubulin användes som en markör för att specifikt identifiera neuroner (Figur 4). Medan BoNT / A klyver SNAP-25 och minskar SNAP-25-signalen, små molekyler som inhiberar någon del av denna process förbättra SNAP-25-signal i avbildningsanalys. Eftersom denna analys beror på fluorescenssignalen genereras från SNAP-25 fördelade över många små neuriter, högkvalitativa bilder är absolut nödvändiga. Därför är automatiserade mikroskop som producerar högupplösta konfokala bilder rekommenderas (Figur 4). Vi fångar rutinmässigt 6-16 fält / brunn i en 96-format när du använder 20X vattenimmersionsobjektiv. Antalet fältets avbildade är beroende av det totala antalet neuriter som krävs för att Generate statistiskt signifikanta resultat.

Modulära bildanalysalgoritmer användes för att extrahera flera parametrar data (Figur 6). Columbus modulära bildanalysalgoritmer är relativt lätta att generera för enklare analysscenarier. För mer komplicerad analys eller utformning av specifika parametrar för komplexa avläsningar, kan Acapella baserade skript användas inom opera miljön samt inom ramen för Columbus. Förutom de fluorescensintensiteter erhållits från SNAP-25 och β-III-tubulin-kanaler, vi rutinmässigt samla in andra parametrar såsom totala cellantalet (indirekt mått på cytotoxicitet), neurit längd, neurit förgrening och andra effektmått att kvantifiera neuronal hälsa under analysen. Rå slutgiltiga data exporteras till statistisk analys av programvara för vidare analys av data och slog val (Figur 7). De data som presenteras här visar förmågan av HCl-analys för att vara efficilunda används för fenotypisk screening i sökandet efter BoNT / A-hämmare med en fysiologiskt relevant motorneuron modell.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Botulinum neurotoxin A	Metabiologics	NA	No catalog number
Microtitre plates	Greiner	655946	Poly-D-Lysine 96-well plates
BACs antibody	Lampire Biological	NA
Microchem	National	0255
Methanol	Thermo Scientific	A412-20
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Horse serum	Invitrogen	16050
PE JANUS MDT Mini Automated Workstation	Perkin Elmer	AJMDT01
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
BIII tubulin antibody	R&D Systems	BAM1195
Tween 20	Sigma	P1379-1L
Hoechst 33342dye	Invitrogen	3570
Antimouse IgG	Invitrogen	A21236
Anti rabbit IgG	Invitrogen	A10042
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Ver 2.4
Spotfire	Perkin Elmer	Ver 5.5
Clorox bleach	Fisher Scientific	18-861-284
PlateStack