Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Summary

Recording Ca²⁺ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca²⁺ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Abstract

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido. O potencial de ação dirigido influxo de Ca2 ⁺ para o terminal pré-sináptico, através de canais de cálcio dependentes da voltagem (VGCCs) localizados na membrana rosto lançamento, é o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores. Crucial para a rapidez da transmissão sináptica é a sincronia espacial e temporal entre a chegada do potencial de acção, e a maquinaria VGCCs a libertação de neurotransmissores. A capacidade de gravar diretamente de Ca2 ⁺ correntes da membrana rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais é imprescindível para uma compreensão precisa da relação entre pré-sináptica de Ca2 ⁺ e liberação de neurotransmissores. Acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica para a gravação eletrofisiológico ainda não está disponível na maioria das preparações e Ca ^{2 +} entrada pré-sináptica tem sido caracterizada utilizando técnicas de imagem e MeasureMe atual macroscópicoNTS – técnicas que não têm resolução temporal suficiente para visualizar Ca2 ⁺ entrada. A caracterização de VGCCs diretamente nos terminais pré-sinápticos individuais não foi possível nas sinapses centrais e, até agora, foi alcançado com sucesso apenas no tipo cálice sinapse do gânglio ciliar e pinto em cálices de ratos. Temos abordado com sucesso este problema na sinapse reticuloespinhal gigante da lampreia medula espinhal através do desenvolvimento de uma preparação agudamente dissociada da medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de estruturas pós-sinápticos. Podemos fluorescently rotular e identificar terminais pré-sinápticos individuais e orientá-las para a gravação. Usando esta preparação, caracterizamos VGCCs diretamente para o rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais usando imunohistoquímica e eletrofisiologia abordagens. Ca2 ⁺ correntes foram registrados diretamente na membrana o rosto liberaçãoterminais pré-sinápticos individuais de f, o primeiro registo a ser realizada nas sinapses centrais.

Introduction

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido e preciso. Ação potencial invasão do terminal pré-sináptico leva à abertura de VGCCs localizados na membrana rosto liberação, o aumento resultante na pré-sináptica de Ca2 ⁺ age como o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores ^1. Todos estes passos ocorrem dentro de centenas de microsegundos ^2, e, portanto, requerem acoplamento espacial de VGCCs apertado para a vesícula máquinas de fusão ^3. Pré-sinápticos de Ca2 ⁺ fluxos têm sido caracterizadas principalmente por meio de imagens abordagens utilizando Ca2 ⁺ corantes sensíveis ^4. Incorporando ^Ca2 tampões que modulam Ca2 ⁺ nos neurónios pré-sinápticos tem sido utilizado para caracterizar indirectamente a relação entre o cálcio pré-sináptico e a neurotransmissão ^3. Além disso, a modulação da pré-sináptico livre concentração de Ca2 ⁺ por uncaging Ca2 ^{+ 5} ou gravação macroscopic correntes de Ca2 ⁺ têm sido utilizados em conjunção com medidas de fusão e / ou a libertação de vesículas; como medidas de capacitância ⁶ ou pós-sinápticos respostas ² para abordar a mesma questão. No entanto, a caracterização de Ca2 ⁺ correntes directamente na face de libertação, a secção especializada da membrana pré-sináptica, onde a despolarização da membrana é convertida em Ca ^{2 +} correntes provocando a fusão das vesículas sinápticas e a libertação de neurotransmissores, é essencial para se obter uma medida precisa do ^Ca2 requisito para a fusão das vesículas sinápticas. Além disso, a capacidade de caracterizar directamente as correntes de Ca2 ⁺ nos terminais pré-sinápticos individuais, acoplado com medições simultâneas precisos de fusão das vesículas e libertação permite uma elucidação preciso da relação de temporização entre o curso do tempo da acção potencial, pré-sináptico corrente ^{2 +} Ca, fusão das vesículas e liberação. Acesso à membrana rosto liberaçãonão está disponível na maior parte dos terminais pré-sinápticos, devido a fechar por aposição dos dendritos pós-sinápticos. Esta inacessibilidade tem sido um grande obstáculo na caracterização de VGCCs uma vez que impede medidas diretas de corrente nos terminais pré-sinápticos individuais. Caracterização direta de pré-sinápticos Ca2 ⁺ correntes nos terminais pré-sinápticos individuais, até agora, não foi possível nas sinapses centrais e só foi alcançado em dois terminais pré-sinápticos do tipo coletor; cálice do tipo sinapse do pinto gânglio ciliar ^7-10 e rato calyces ^11,12. Em todos os outros terminais pré-sinápticos, incluindo a sinapse reticuloespinhal gigante na lampreia medula espinhal ^13, a falta de acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica exigiu o uso de abordagens indiretas, tais como Ca2 ⁺ radiológico para o estudo pré-sinápticos de Ca2 ⁺ fluxos.

<img alt="Figura 1" fo: content-width = src "5 polegadas" = "/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg" width = "500" />
Figura 1 lampreia sinapse reticuloespinhal gigante. (A) Secção transversal da lampreia medula espinhal indicando orientação dorso-ventral. Axônios reticulospinais são marcadas com asterisco verde. (B) reconstrução 3-D da sinapse reticuloespinhal na lampreia medula espinhal mostrando axônio pré-sináptico reticuloespinhal fazendo numerosos en passant contatos (marcado por setas verdes) sobre o neurônio pós-sináptico ^13. Terminais pré-sinápticos têm sido marcados com Alexa Fluor 488 conjugado com hidrazida faloidina (verde), enquanto que o neurónio pós-sináptico foi preenchido com Alexa Fluor 568 hidrazida (vermelho).

Lampreia gigantes axônios reticulospinais, localizado na região ventral da medula espinhal paralelo ao eixo Figura 1a rostral-caudal, forma múltipla en passant contatos sinápticos em neurônios doespinhal chifre ventral ¹⁴ Figura 1b ^13. De célula inteira macroscópica ^Ca2 correntes foram registadas a partir de axônios reticulospinais na medula espinhal intacta ^13,15. No entanto, tentativas anteriores para cegos medição directa de correntes de Ca ^{2 +} em axónios reticulospinais na medula espinhal lampreia intacto usando ligado de células técnica de fixação de membranas ^13, não têm tido sucesso, devido à falta de acesso à membrana cara de libertação pré-sináptica devido aos processos de pós-sinápticos opostas Figura 1b. A membrana de libertação cara tenha sido previamente tornado acessível pela remoção do neurónio pós-sináptico ^11, perturbação mecânica da sinapse antes da gravação de ¹² ou tratamento enzimático acoplado com dissociação mecânica ^16. Dada a complexa organização da medula espinhal, que seria extremamente difícil identificar o neurônio pós-sináptico e recolhê-lo mecanicamente ou perturbar ªe sinapse. Por isso, decidimos usar o tratamento enzimático ¹⁷ seguido de dissociação mecânica.

Usando essa abordagem, temos desenvolvido uma preparação profundamente dissociada da lampreia medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados viáveis ​​com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de quaisquer processos de pós-sinápticos, proporcionando assim o acesso irrestrito aos terminais pré-sinápticos individuais. Em conjunto com um microscópio invertido padrão e imagens de fluorescência, que nos permite identificar e alvejar terminais pré-sinápticos fluorescente identificados individualmente, com uma pipeta de patch que contém uma solução de gravação que isola as correntes de Ca2 ⁺ 4c figura e Figura 4d, para gravar utilizando célula- ligado técnica tensão-grampo. Ca2 ⁺ correntes foram registrados diretamente na membrana rosto liberação pré-sináptica de indivíduo terminais pré-sinápticos Figura 4f. Este é um significant avanço no campo da transmissão sináptica, uma vez que é o primeiro exemplo de gravação a ser realizada nas sinapses centrais.

Protocol

1: Preparação de poli-D-lisina Hydrobromide Prepare 1 mg / ml de bromidrato de poli-D-lisina em tampão borato 0,1 M (pH 8,5). Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Revestimento 2 Poli-lisina de Lamelas Nota: Executar todas as etapas de limpeza e revestimento em uma câmara de fluxo laminar. Coloque lamelas em uma placa de Petri contendo 1 N de ácido clorídrico (HCl) durante 2 horas. Aspirar todo o HCl e enxágüe …

Representative Results

Isso gera protocolo dissociação saudáveis ​​e funcionais axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter os terminais pré-sinápticos funcionais capazes de evocado vesículas sinápticas exo-e endocitose Figura 4c e 4d Figura. Secções das regiões isoladas dos axônios reticulospinais podem ser claramente identificados em microscópio de luz para estar livre de quaisquer outros processos…

Discussion

Nosso protocolo de dissociação é significativo por ceder axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter funcional pré-sináptica terminais Figura 4c e 4d Figura. A ausência de processos pós-sinápticos que se opõem ao terminal pré-sináptico permite o acesso a gravação direta para a membrana rosto liberação pré-sináptica nos terminais pré-sinápticos individuais, que não eram possíveis…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
0.2 µm syringe filter	EMD Millipore	SLGV004SL
22×60 mm coverslips	Fisherbrand	12545J
Advasep-7	Cydex Pharmaceuticals	ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen/Life Technologies	A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen/Life Technologies	A21070
Antifreeze	Prestone
Boric acid	Sigma-Aldrich	B7660
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Bright field light source	Dolan-Jenner	Fiberlite 180
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Cover slip	Fisher-Scientific	12-545-J
Dextrose	Sigma-Aldrich	D9559
Digital CCD Camera	Hamamatsu	C8484-03G01
Dissection fine forceps	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dissection microscope	Leica Biosystems	Leica MZ 12
Dissection scissors	Fine Science Tools	15025-10
Dissection scissors fine	Fine Science Tools	91500-09
Dissection scissors ultra fine	Fine Science Tools	15000-08
FM 1-43	Invitrogen/Life Technologies	T3163
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523
High vacuum grease	Dow-Corning
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA-56-500
Immersion oil	Fisher-Scientific	M2000
Industrial grade Nitrogen gas tank	Praxair	UN1066
Insect pins	Fine Science Tools	26002-10
Liquid suture glue	Braun Veterinary Cair Division	8V0305	The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M2670
Methanol	Sigma-Aldrich	154903
Non-fat dry milk	Cell Signaling Technology	9999S
P-87 Micropipette puller	Sutter Instruments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Perfusion pump	Cole-Palmer	Masterflex C/L
Petri dish 100×15 mm	Fisher-Scientific	875712
Petri dish 35×10 mm	Fisher-scientific	875712
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1024	MW > 300000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Primary antibodiesR-type calcium channel	Alomone Labs	ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Scalpel blades	World Precision Instruments	500240
Schot Duran Preesure Bottle	Fisher-Scientific	09-841-006
Silicone tubing for glue application	Cole-Palmer	07625-26
Slicing base plate	Leica Biosystems	14046327404
Slicing chamber	Leica Biosystems	1.4046E+10
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide		S8045
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 160	To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	SYLGARD® 184	To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps	Fine Science Tools	11626-11
Tricaine methanesulphonate	Sigma-Aldrich	A5040
Vibratome blades	World Precision Instruments	BLADES
Xenon lamp	Nikon