Мышечные сенсорные нейроны вовлечены в Проприоцептор сигнализации, а также доклад о метаболических государственных и травм, связанных с событиями. Опишем взрослую мышь в пробирке подготовки мышц нерва для исследований натяжных активированного мышечных афферентов.
Мышечные сенсорные нейроны, иннервирующие мышцы шпиндели и Гольджи сухожилия органы кодировать изменения длины и силы, необходимые для проприоцепции. Дополнительные афферентные волокна контролировать другие характеристики среды мышц, в том числе наращивание метаболита, температуры и ноцицептивных стимулов. В целом, ненормальное активация сенсорных нейронов может привести к двигательных расстройств или хронических болевых синдромов. Опишем изоляцию пальцев мышцы (EDL) мышцы и нерва для исследования в пробирке натяжных-вызвали афферентных реакций в взрослой мыши. Сенсорная действия записываются от нерва с всасывающим электродом и индивидуальные афференты могут быть проанализированы с помощью шипа сортировки программного обеспечения. В пробирке препараты позволяют хорошо контролируемых исследований по сенсорных афферентов без потенциальных смешивает анестезии или изменены мышечной перфузии. Здесь мы опишем протокол для выявления и проверить реакцию мышц шпинделя афферентов растянуть. Важно отметить, чтоэтот препарат также поддерживает изучение других подтипов мышечных афферентов, свойства реагирования после применения препарата и включения мощных генетических подходов и моделей заболеваний у мышей.
Скелетные мышцы иннервируются сенсорными нейронами, которые предоставляют на центральную нервную систему с важной информацией о состоянии окружающей среды мышц. Мышечные веретена являются узкоспециализированными инкапсулированные структуры, состоящие из интрафузальных мышечных волокон, расположенных параллельно с extrafusal мышечных волокон. Шпиндели иннервируются группы Ia и II афферентов, которые кодируют изменения длины мышц и интрафузальных тоном волокна динамически регулируется иннервирующих гамма моторных нейронов 1. Группы IB афферентов расположены между мышечными волокнами и их сухожилий и чувствительны к изменениям в мышечной силы, например, при сокращении мышц 2. Группа Ia, Ib и афференты II обеспечивают проприоцептивной обратной связи, что помогает в соответствующем управления двигателем. Дополнительные популяции мышечных афферентов, расположенных по всей мышцы (Группа III и IV), служат для накопления сигнала метаболита, присутствие ноцицептивных стимулов и температуру мышц <sup> 3. Эта мышца сенсорная информация имеет решающее значение для поддержания гомеостаза, предотвращая повреждение мышц и модуляции движение. Мышечные афференты может изменить свои модели огневые основе предшествующего опыта 4. Активация болевых рецепторов может привести к индукции хронической боли и 5 аберрантной сигнализации от мышечных проприоцепторов может привести к проблемам с балансом или движения 6. Мы используем изолированный мышц-нерв в пробирке подготовки изучить реакцию окончаний сенсорных рецепторов нейронов мышц от взрослых мышей обоих полов (показанных ответы от 2-4 месяца старый мышей C57BL / 6). Мышь является модель генетического видов для исследований у млекопитающих. Этот препарат требуется выделение глубокой малоберцового ветви седалищного нерва и длинный разгибатель пальцев (EDL) мышцы, быстро дергаться мышцы малоберцового группы, найденного в боковой части голени. EDL часто используется для изучения мышц сократительные свойства 7-9, имеет TEndons, которые легко изолировать и достаточно мал, чтобы обеспечить достаточное снабжение диффузионного кислорода в покое и с разумными циклов сжатия грузоподъемности 10. Другие мышцы в этой области (например камбаловидной и передней большеберцовой) имеют одинаковый размер и этот препарат может быть легко модифицирована для записи с афферентов из этих мышц. Всасывания электрод помещают на обрезанный конец нерва, чтобы записать мышц сенсорной афферентной стрельбы. Индивидуальные нейроны могут быть выявлены и проанализированы на основе их спайка форме с использованием шип сортировки программного обеспечения. Стимулирующих электродов в ванной или на нерв может быть использован, чтобы вызвать сокращение мышц. Длина мышцы и сила, можно контролировать и измеряется с использованием коммерчески доступных систем. Похожие на препараты пробирке были использованы на грызунах учиться Группа III и IV мышечные афференты на крысах EDL 11, Группа Ia и II шпинделя афферентов в крыс четвертой червеобразная ног мышцы 12 и группа III и IV мышечные афференты в тон мышь подошвенной мышцы 13.
Система в пробирке имеет преимущества фармакологической доступности и непосредственным контролем перфузата и физико-химических переменных, таких как температура и рН. Подход в пробирке устраняет потенциал в естественных условиях смешивает анестезии и мышечной статуса перфузии. В то время как подготовка мышц-нерва позволяет для изучения прямого ответа возмущения на афферентов, способность учиться гамма эфферентной модуляцию шпинделя чувствительности и других комплексных мер, которые можно с в естественных условиях 14 или экс естественных 3 препараты приносится в жертву, как нет нейронные клеточные тела в данном препарате.
Этот препарат был ранее использован для характеристики реакции мыши мышцы шпинделя афферентов к батарее рампы и удерживайте участки и вибрации и было определено, что шпинделя мыши афферентные Responsэс были аналогичны приведенным в других видах, таких как крысы, кошки и человека. Мыши реакции шпинделя афферентные Было обнаружено, что аналогично как на 24 ° C и 34 ° C температуре ванны, хотя при 34 ° С ставок абсолютное обжига были быстрее и афферентов были более способны реагировать на более быстрого изменения длины 15. Ниже мы описываем, как этот препарат может быть использован для определения и изучения афференты мышцы шпинделя. Кроме того, этот препарат может быть легко изменен, чтобы изучить реакцию с другими подтипами мышцы афферентных 13, чтобы сравнить свойства сенсорных афферентных волокон в ответ на состояние лекарственного средства или заболевания или различных других переменных (например, возраст, пол, ген нокаут).
Цель этой статьи заключается в описании способа записи с мышц шпинделя афферентов в изолированной подготовки мышь мышц нерва. Мы обнаружили, что шпиндель мыши афферентов реагировать аналогично растягиваться, как и у крыс, кошек и человека 15, и других лабораторий использовали мышей в качестве модельных организмов для изучения сенсорных нейронов как в мышцах и коже в пробирке (например, 3,13) .
Мышечные сенсорные афферентные могут быть записаны, по крайней мере 6-8 часов при обоих 24 ° С и 34 ° С. Чтобы свести к минимуму обработки EDL и нерва, используют оставшуюся часть FHL для обработки ткани, когда это возможно. После вскрытия, ждать по крайней мере 1 час, чтобы начать сбор данных, чтобы позволить ткани, чтобы уравновесить до температуры ванны и для нормальной синаптической передачи, чтобы восстановиться. Ранее здоровья мышц была проверена на подмножестве мышц, используемых в этом препарате, определяя, что максимальное тетанической Contractile сила, создаваемая мышц аналогичен тому, что описан другими в начале и в конце эксперимента 15.
Мышечные афференты шпинделя были определены функционально в данном препарате, глядя на характерной паузы в стрельбе в ответ дергаться сокращение (рисунок 2), а также ожидаемые мгновенные частота увеличивается в ответ на изменения длины (рисунок 3). По нашему опыту, большинство афференты, что огонь в условиях контроля являются мышцы шпинделя афференты. Длина нерва сохраняется в этом препарате (~ 7 мм максимум) не достаточно долго, чтобы использовать афферентные различия скорости проводимости для определения мышечной афферентные подтипы 13. Кроме того, в отличие от кошек и людей, меры динамической чувствительностью не смогли четко дифференцировать группы IA и афференты II у мышей (для дальнейшего обсуждения см Уилкинсон и соавт. 15). Другие подтипы афферентов (т.е.., Группа III и IV), могут быть идентифицированы с помощью дополнительных функциональных тестов в этом препарате, например, путем добавления веществ, как капсаицин, АТФ или брадикинина, снижение рН ванны, подвергая мышцы к ишемии и т.д. 3,13,21-23 Использование всасывающего электродов позволяет активности из нескольких сенсорных нейронов, которые будут записаны сразу же, что увеличивает количество данных, которые могут быть получены от одной мышцы. Этот препарат может использоваться для оценки общего эффекта возмущения на сенсорных реакций нейрона населения или ответах выявленных афферентов. Если шипованные формы достаточно уникальный, до 4 сенсорных нейронов может быть подвергнут дискриминации с помощью программного обеспечения (как Spike2 (Cambridge Electronic Design) и LabChart Pro (AD Instruments) провели аналогично). В тех случаях, когда нейроны не может быть различен, изменения в размещении электродов или диаметр наконечника может быть легко реализовано.
Таким образом, мышь мышцы нерва в пробирке В ведениевания является простой экспериментальный подход, который может быть использован для исследования свойств отклика мышечных сенсорных афферентов в различных физико-химических возмущений, травм и болезней моделей. Кроме того, этот препарат идеально подходит, чтобы воспользоваться мощными генетических инструментов, доступных на мышах, в том числе трансгенных животных и optogenetic инструментов.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |