Muscle neurones sensoriels sont impliqués dans la signalisation propriocepteur et signalent également sur les événements métaboliques de l'Etat et des blessures liées. Nous décrivons une souris adulte in vitro préparation musculaire du nerf pour les études sur les afférences musculaires extensibles activé.
Muscle neurones sensoriels innervant les fuseaux neuromusculaires et organes tendineux de Golgi codent des changements essentiels à la proprioception longueur et de force. Fibres afférentes supplémentaires surveillent d'autres caractéristiques de l'environnement musculaire, y compris métabolite accumulation, de la température, et des stimuli nociceptifs. Dans l'ensemble, une activation anormale des neurones sensoriels peut conduire à des troubles du mouvement ou des syndromes de douleur chronique. Nous décrivons l'isolement du long extenseur des orteils (EDL) musculaire et nerveuse pour l'étude in vitro des réponses afférentes étirement évoqué chez la souris adulte. Activité sensorielle est enregistré à partir du nerf avec une électrode d'aspiration et les afférences individuelles peut être analysé en utilisant un logiciel de tri pic. In vitro préparations permettent des études bien contrôlées sur les afférences sensorielles sans les facteurs de confusion potentiels de l'anesthésie ou modifié perfusion musculaire. Nous décrivons ici un protocole pour identifier et tester la réponse des afférences de broche de muscle à l'étirement. Fait important,cette préparation prend également en charge l'étude des autres sous-types de afférences musculaires, des propriétés de réponse suite à l'application de la drogue et de l'incorporation des approches génétiques puissants et des modèles de la maladie chez les souris.
Les muscles squelettiques sont innervés par les neurones sensoriels qui fournissent le système nerveux central des renseignements importants sur l'environnement musculaire. Les fuseaux neuromusculaires sont des structures composées de fibres encapsulées musculaires intrafusoriales qui se trouvent en parallèle avec les fibres musculaires extrafusales hautement spécialisés. Broches sont innervés par le groupe Ia et II afférences qui codent pour des changements dans la longueur du muscle et intrafusales ton de fibre est dynamique réglementés par les neurones moteurs innervant gamma 1. Groupe afférences Ib sont positionnés entre les fibres musculaires et de leurs insertions tendineuses et sont sensibles aux variations de la force musculaire, par exemple au cours de la contraction du muscle 2. Le groupe Ia, Ib et II afférences proprioceptives fournissent une rétroaction qui aide dans le contrôle moteur approprié. D'autres populations de afférences musculaires situées tout au long du muscle (groupes III et IV) servir pour signaler une accumulation metabolite, la présence de stimuli nociceptifs, et la température des muscles <sup> 3. Cette information sensorielle musculaire est essentielle au maintien de l'homéostasie, la prévention des lésions musculaires et la modulation de mouvement. afférences musculaires peuvent modifier leurs modes de tir basé sur l'expérience avant 4. Activation des nocicepteurs peut conduire à l'induction de la douleur chronique et de la signalisation aberrante 5 des propriocepteurs musculaires peuvent conduire à des problèmes d'équilibre ou de mouvement 6. Nous utilisons un muscle-nerf isolé dans la préparation in vitro pour étudier la réponse des muscles terminaisons des récepteurs des neurones sensoriels de souris adultes des deux sexes (indiqués sont des réponses 2-4 mois vieux souris C57BL / 6). La souris est l'espèce modèle pour les études génétiques chez les mammifères. Cette préparation nécessite l'isolement de la branche profonde péronier du nerf sciatique et le muscle long extenseur des orteils (EDL), un muscle à contraction rapide du groupe péronier trouve dans la partie latérale de la jambe inférieure. Le permis de conduire est souvent utilisé pour étudier les propriétés contractiles des muscles 7-9, a tendons qui sont faciles à isoler et est suffisamment petit pour permettre l'apport d'oxygène par diffusion adéquate au repos et aux cycles raisonnables en matière de droits de contraction 10. D'autres muscles dans ce domaine (par exemple soléaire et jambier antérieur) sont de taille similaire et cette préparation pourraient facilement être modifiés pour enregistrer à partir d'afférences de ces muscles. Une électrode d'aspiration est placé sur l'extrémité du nerf sensoriel pour enregistrer muscle afférents cuisson de coupe. Neurones individuels peuvent être identifiés et analysés en fonction de leur forme de pointe Piquet logiciel de tri. La stimulation des électrodes dans le bain ou sur le nerf peut être utilisé pour évoquer la contraction musculaire. la longueur du muscle et de la force peuvent être contrôlées et mesurées à l'aide de systèmes disponibles dans le commerce. Similaires dans les préparations in vitro ont été utilisés chez les rongeurs pour étudier Groupe III et IV afférences musculaires chez le rat EDL 11, groupe Ia et II afférences de broche chez le rat quatrième lombrical muscle orteil 12 et Groupe III et IV musculaires afférences en til plantaire de souris muscle 13.
Un système in vitro a les avantages de l'accessibilité pharmacologique et un contrôle direct de variables perfusat et physico-chimiques telles que la température et le pH. Une approche in vitro élimine le potentiel in vivo confond l'anesthésie et le muscle état de perfusion. Bien que la préparation nerf-muscle permet l'étude de la réponse directe d'une perturbation sur les afférences, la possibilité d'étudier la modulation gamma efférent de sensibilité broche et d'autres réponses intégrées qui est possible avec 14 in vivo ou ex vivo trois préparations sont sacrifiés il n'y a pas de corps cellulaires neuronaux de cette préparation.
Cette préparation a déjà été utilisé pour caractériser la réponse des afférences de broche de muscle de souris à une batterie de rampe et tenir les étirements et les vibrations et il a été déterminé que les responsab afférentes de la broche de la sourises étaient similaires à ceux rapportés dans d'autres espèces comme le rat, le chat et l'homme. Souris réponses broche afférentes ont été jugés similaires à la fois 24 ° C et 34 ° la température du bain de C, mais à 34 ° C des taux de combustion absolue étaient plus rapides et les afférences sont plus en mesure de répondre à la longueur plus rapide change 15. Nous décrivons ci-dessous comment cette préparation peut être utilisée pour identifier et étudier les afférences du fuseau musculaire. En outre, cette préparation peut être facilement modifié pour étudier la réponse des autres sous-types afférentes musculaire 13, à comparer les propriétés des afférences sensorielles en réponse à un état de drogue ou d'une maladie ou d'autres variables assortis (par exemple, l'âge, le sexe, le gène knock-out).
Le but de cet article est de décrire une méthode pour enregistrer à partir des afférences du fuseau musculaire dans une préparation souris muscle-nerf isolé. Nous avons trouvé que les afférences de la broche de la souris réagissent de manière similaire à étirer que celles de rats, les chats et les humains 15 et d'autres laboratoires ont utilisé des souris comme organismes modèles pour étudier les neurones sensoriels à la fois dans le muscle et la peau in vitro (par exemple 3,13) .
Muscle afférences sensorielles peuvent être enregistrées pendant au moins 6-8 heures à la fois 24 ° C et 34 ° C. Afin de minimiser la manipulation du EDL et nerveuse, utiliser la partie restante de la FHL à manipuler le tissu chaque fois que possible. Après la dissection, attendre au moins 1 heure pour commencer la collecte de données pour permettre le tissu s'équilibrer à la température du bain et de la transmission synaptique normale pour récupérer. Auparavant, la santé des muscles ont été vérifiées sur un sous-ensemble de muscles utilisés dans cette préparation en déterminant que la contra maximale tétaniquectile active générée par les muscles est similaire à celle rapportée par d'autres au début et à la fin de l'expérience 15.
Muscle afférences de la broche ont été identifiés fonctionnellement dans cette préparation par la recherche d'une pause caractéristique à tirer en réponse à la contraction contraction (figure 2) ainsi que la fréquence augmente instantanées attendus en réponse aux changements de longueur (Figure 3). Dans notre expérience, la plupart des afférences qui tirent dans des conditions de contrôle sont les afférences du fuseau musculaire. La longueur du nerf retenu dans cette préparation (~ 7 mm maximum) n'est pas assez longtemps pour utiliser les différences de vitesse de conduction afférents à identifier les sous-types afférentes musculaire 13. En outre, contrairement à chez les chats et les humains, les mesures de sensibilité dynamique n'étaient pas en mesure de différencier clairement groupe Ia et les afférences II chez la souris (pour plus de discussion, voir Wilkinson et al. 15). D'autres sous-types de fibres afférentes (c.. Groupe III et IV) peuvent être identifiés en utilisant des tests fonctionnels supplémentaires dans cette préparation, par exemple par addition de substances comme la capsaïcine, de l'ATP, ou la bradykinine, ce qui diminue le pH bain, ce qui expose le muscle à une ischémie, etc 3,13,21-23 En utilisant des électrodes d'aspiration permet l'activité des neurones sensoriels de multiples devant être enregistrées en même temps, ce qui augmente la quantité de données qui peuvent être collectées à partir d'un seul muscle. Cette préparation peut être utilisé pour évaluer l'effet global d'une perturbation sur sensorielles réponses des populations de neurones ou les réponses des afférences identifiés. Si les formes de pic sont assez uniques, jusqu'à 4 neurones sensoriels peuvent être discriminés par le logiciel (à la fois Spike2 (Cambridge Electronic Design) et Pro LabChart (AD Instruments) ont effectué la même manière). Dans les cas où les neurones ne peuvent pas être discriminés, les changements dans le placement des électrodes ou le diamètre de la pointe peuvent facilement être mises en œuvre.
En résumé, la souris muscle-nerf en prépar vitroation est une approche expérimentale simple qui peut être utilisé pour étudier les propriétés de réponse des muscles afférences sensorielles à différents modèles perturbations, les blessures et les maladies physico-chimiques. En outre, cette préparation est idéale pour profiter des outils génétiques puissants disponibles chez la souris, y compris les animaux transgéniques et des outils optogénétiques.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
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Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
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Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |