Muskel sensoriske neuroner er involveret i proprioceptor signalering og også rapportere om metaboliske tilstand og skade relaterede begivenheder. Vi beskriver en voksen mus in vitro forberedelse muskel-nerve til undersøgelser af stræk-aktiverede muskel afferenter.
Muskel sensoriske neuroner innerverer muskel spindler og Golgi sene organer indkode længde og tvinge ændringer er vigtige for proprioception. Yderligere afferente fibre overvåge andre egenskaber musklen miljøet, herunder metabolit opbygning, temperatur og nociceptive stimuli. Samlet set kan unormal aktivering af sensoriske neuroner føre til lidelser i bevægeapparatet eller kroniske smerter syndromer. Vi beskriver isoleringen af extensor digitorum longus (EDL) muskel og nerve til in vitro-undersøgelse af stræk-fremkaldte afferente reaktioner i den voksne mus. Sensorisk aktivitet er optaget fra nerven med en suge elektrode og individuelle afferenter kan analyseres ved hjælp af spyd sortering software. In vitro præparater giver mulighed for velkontrollerede undersøgelser af sensoriske afferenter uden de potentielle forvirrer af bedøvelse eller ændret muskel perfusion. Her beskriver vi en protokol til at identificere og teste responsen af muskel spindel afferente at strække. Vigtigere er det,dette præparat understøtter også undersøgelse af andre undertyper af muskel afferente, respons egenskaber efter narkotika ansøgning og indarbejdelse af kraftige genetiske metoder og sygdomsmodeller i mus.
Skeletmuskulatur er innerverede af sensoriske neuroner, der giver det centrale nervesystem med vigtige oplysninger om muskel miljø. Muskel spindler er stærkt specialiserede indkapslede strukturer sammensat af intrafusal muskelfibre, der er placeret parallelt med extrafusal muskelfibre. Spindler er innerverede af gruppe IA og II afferenter der koder ændringer i muskel længde og intrafusal fiber tone dynamisk reguleret af innerverer gamma motoriske neuroner 1. Gruppe Ib afferente er anbragt mellem muskelfibre og deres sener insertioner og er følsom over for ændringer i muskel kraft, for eksempel under muskelsammentrækning 2. Koncernen Ia, Ib og II afferenter giver proprioceptive feedback, der hjælper i passende motorstyring. Yderligere populationer af muskel afferente placeret overalt i musklen (gruppe III og IV) tjener til at signalere metabolit oprustning, tilstedeværelsen af nociceptive stimuli, og muskel temperatur <sup> 3. Denne muskel sensorisk information er nødvendig for at opretholde homeostase og forebygge muskelskader og modulerende bevægelse. Muskel afferenter kan ændre deres fyring mønstre baseret på tidligere erfaringer 4. Aktivering af nociceptorer kan føre til induktion af kroniske smertetilstande 5 og afvigende signalering fra muskel proprioceptorer kan føre til problemer med balancen eller bevægelse 6. Vi bruger en isoleret muskel-nerve in vitro forberedelse til at studere svar af muskel sensorisk neuron receptor endelser fra voksne mus af begge køn (vist er svar 2-4 måneder gammel C57BI / 6 mus). Musen er den model genetiske arter af pattedyr. Dette præparat kræver isoleringen af den dybe peroneal gren af iskiasnerven og extensor digitorum longus (EDL) muskel, et hurtigt ryk muskel i peroneal gruppe findes i den laterale del af underbenet. EDS er ofte bruges til at studere muskel kontraktile egenskaber 7-9, har tendons der er lette at isolere og er lille nok til at tillade tilstrækkelig diffusive iltforsyning i hvile og med rimelige sammentrækning duty cycles 10. Andre muskler i dette område (f.eks soleus og tibialis anterior) er af samme størrelse, og denne forberedelse kan let ændres til at optage fra afferenter fra disse muskler. En suge elektrode placeres på den afskårne ende af nerven til at optage muskel sensorisk afferent fyring. Individuelle neuroner kan identificeres og analyseres på grundlag af deres spids form ved hjælp af spike sortering software. Stimulering elektroder i badet eller på nerven kan anvendes til at fremkalde muskelkontraktion. Muskel længde og kraft kan styres og måles under anvendelse af kommercielt tilgængelige systemer. Lignende in vitro præparater er blevet anvendt i gnavere til at studere Gruppe III og IV muskel afferenter i rotter EDL 11, gruppe IA og II spindel afferenter hos rotter fjerde lumbrical tå muskel 12 og gruppe III og IV muskel afferenter ithan mus plantar muskel 13.
Et in vitro-system har fordelene farmakologisk tilgængelighed og direkte styring af Perfusatprøver og fysiokemiske variabler som temperatur og pH. En in vitro-fremgangsmåde eliminerer potentiale in vivo forvirrer af anæstesi og muskel perfusion status. Mens muskel-nerve præparat giver mulighed for undersøgelse af den direkte reaktion på en forstyrrelse på afferente, evnen til at studere gamma efferente modulering af spindel følsomhed og andre integrerede reaktioner, der er muligt med in vivo 14 eller ex vivo tre præparater ofres som der er ingen nervecellelegemer i dette præparat.
Dette præparat blev tidligere brugt til at karakterisere respons musemusklen spindel afferenter til et batteri af rampe og hold strækninger og vibrationer, og det blev fastslået, at mus spindel afferente responses svarede til dem rapporteret i andre arter, såsom rotter, katte og mennesker. Mus spindel afferente responser blev fundet at være ens på både 24 ° C og 34 ° C-badet temperaturer, selv ved 34 ° C absolut fyring satser var hurtigere og de afferente var bedre i stand til at reagere hurtigere længde ændringer 15. Vi beskriver nedenfor, hvordan dette præparat kan bruges til at identificere og studere muskel spindel afferenter. Endvidere kan dette præparat let modificeres til at undersøge reaktionen af andre muskel afferente undertyper 13, for at sammenligne egenskaberne af sensoriske afferenter som reaktion på et lægemiddel eller sygdomstilstand eller diverse andre variable (fx alder, køn, gen-knockout).
Målet med denne artikel var at beskrive en metode til optagelse fra muskel spindel afferenter i et isoleret præparat mus muskel-nerve. Vi har fundet, at mus spindel afferente reagere på samme måde at strække som dem fra rotter, katte og mennesker 15 og andre laboratorier har anvendt mus som modelorganismer at studere sensoriske neuroner i både muskel og hud in vitro (for eksempel 3,13) .
Muskel sensoriske afferente kan optages i mindst 6-8 timer ved både 24 ° C og 34 ° C. For at minimere håndtering EDL og nerve, bruge den resterende del af FHL at håndtere væv når det er muligt. Efter dissektion, vente mindst 1 time for at starte dataindsamlingen at tillade væv afbalancere til bad temperatur og til normal synaptisk transmission at komme sig. Tidligere blev muskel sundhed kontrolleret på en delmængde af muskler, der bruges i dette præparat ved at fastslå, at den maksimale tetanisk contractile kraft, der genereres af musklerne er den samme som rapporteret af andre ved begyndelsen og slutningen af eksperimentet 15.
Muskel spindel afferente blev identificeret funktionelt i dette præparat ved at lede efter en karakteristisk pause i fyring som reaktion på spjæt sammentrækning (figur 2), samt de forventede øjeblikkelige frekvens stigninger i respons på længdeændringer (Figur 3). Det er vores erfaring, de fleste afferenter at brand i kontrolforanstaltninger opfylder muskel spindel afferenter. Længden af nerve bevaret i dette præparat (~ 7 mm maksimum) er ikke lang nok til at bruge afferente ledningshastighed forskelle identificere muskel afferente undertyper 13. Derudover, i modsætning til hos katte og mennesker, foranstaltninger af dynamisk følsomhed ikke var i stand til klart at skelne gruppe IA og II afferenter i mus (for yderligere diskussion se Wilkinson et al. 15). Andre undertyper af afferente (dvs.., Gruppe III og IV) kan identificeres ved hjælp af yderligere funktionelle tests i dette præparat, for eksempel ved at tilsætte stoffer som capsaicin, ATP, eller bradykinin, faldende bad pH, udsætter musklen til iskæmi mv 3,13,21-23 Brug sugeelektroder tillader aktivitet fra flere sensoriske neuroner, der skal optages på én gang, som øger mængden af data, der kan indsamles fra en enkelt muskel. Dette præparat kan anvendes til at måle den samlede effekt af en forstyrrelse på sensoriske neuron befolkningsgrupper responser eller responser identificerede afferenter. Hvis spike figurer er unikke nok, kan op til 4 sensoriske neuroner blive diskrimineret af software (både Spike2 (Cambridge Electronic Design) og LabChart Pro (AD instrumenter) har udført på samme måde). I tilfælde, hvor neuroner kan ikke blive diskrimineret, kan ændringer i placering af elektroder eller spids diameter nemt implementeres.
Sammenfattende musemusklen-nerven in vitro preparation er en simpel eksperimentel tilgang, der kan bruges til at undersøge respons egenskaber af muskel sensoriske afferenter til forskellige fysisk-kemiske forstyrrelser, skader og sygdomsmodeller. Derudover er dette præparat velegnet til at drage fordel af de stærke genetiske værktøjer til rådighed i mus, herunder transgene dyr og optogenetic værktøj.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |