Muscle sensoriska nervceller är inblandade i proprioceptor signalering och även rapportera om metabola statliga och skaderelaterade händelser. Vi beskriver en vuxen mus i muskel-nerv vitro förberedelse för studier på stretch-aktiverade muskel afferenter.
Muscle sensoriska nervceller som innerverar muskelspolar och Golgisenans organ koda förändringar som är väsentliga för proprioception längd och kraft. Ytterligare afferenta fibrer övervaka andra egenskaper hos muskelmiljön, bland metabolit uppbyggd, temperatur och nociceptiva stimuli. Sammantaget kan onormal aktivering av sensoriska neuroner leda till rörelserubbningar eller kroniska smärtsyndrom. Vi beskriver isoleringen av extensor digitorum longus (EDL) muskel och nerv för in vitro-studie av stretch-framkallade afferenta svar i den vuxna musen. Sensorisk aktivitet registreras från nerven med en sug elektrod och individuella afferenter kan analyseras med hjälp av spik sortering programvara. In vitro förberedelserna möjliggöra välkontrollerade studier på sensoriska afferenta nerver utan de potentiella blandar ihop narkos eller förändrad muskelblödning. Här beskriver vi ett protokoll för att identifiera och testa svaret av muskelspindel afferenter att sträcka. Viktigtdetta preparat stöder också studiet av andra undergrupper av muskel afferenter, svars egenskaper enligt läkemedelsansökan och införlivandet av kraftfulla genetiska metoder och sjukdomsmodeller i möss.
Skelett muskler innerveras av sensoriska nervceller som ger det centrala nervsystemet med viktig information om muskelmiljön. Muscle spindlar är högt specialiserade inkapslade strukturer sammansatta av intrafusal muskelfibrer som finns parallellt med extrafusal muskelfibrer. Spindlar är innerveras av koncern Ia och II afferenter som kodar förändringar i muskellängd och intrafusal fiberston dynamiskt regleras av innervating gamma motoriska nervceller 1. Grupp Ib afferenter är placerade mellan muskelfibrer och deras senor insättningar och är känsliga för förändringar i muskelkraft, till exempel vid muskelsammandragning 2. Koncernen Ia, Ib och II afferenter ger proprioceptiva återkoppling som stöd i lämplig motorstyrning. Ytterligare populationer av muskel afferenter ligger i hela muskeln (grupp III och IV) tjänar till att signalera metabolit uppbyggd, förekomsten av nociceptiva stimuli, och muskeltemperatur <sup> 3. Denna muskel sensorisk information är avgörande för att upprätthålla homeostas, förebygga muskelskador och modulerande rörelse. Muskel afferenter kan förändra sina bränning mönster baserade på tidigare erfarenhet 4. Aktivering av nociceptorer kan leda till induktion av kroniska smärttillstånd 5 och avvikande signalering från muskel proprioceptorer kan leda till problem med balans eller rörelse 6. Vi använder en isolerad muskel-nerv in vitro förberedelse för att studera responsen av muskel sensoriska neuron receptor ändelser från vuxna möss av båda könen (visas är responser 2-4 månader gamla C57BL / 6 möss). Musen är modellen genetiska arter för studier i däggdjur. Denna beredning kräver isolering av den djupa peroneal grenen av ischiasnerven och extensor digitorum longus (EDL) muscle, en snabb ryckning muskeln i peroneal grupp funnen i den laterala delen av underbenet. EDL används ofta för att studera muskel sammandragande egenskaper 7-9, har tendons som är lätta att isolera och är tillräckligt liten för att ge tillräcklig diffusesyretillförsel i vila och med rimliga kontraktion driftcykler 10. Andra muskler i detta område (t.ex. soleus och tibialis anterior) är av liknande storlek och detta preparat kan lätt modifieras för att spela in från afferenter från dessa muskler. Ett sug elektrod placeras på den avskurna ändan av mage att spela muskel sensoriska afferenta bränning. Enskilda nervceller kan identifieras och analyseras utifrån deras spik form med spik sortering programvara. Stimulerande elektroder i badet eller på nerven kan användas för att framkalla muskelsammandragning. Muskel längd och kraft kan kontrolleras och mätas med hjälp av kommersiellt tillgängliga system. Liknande in vitro-preparat har använts i gnagare för att studera i grupp III och IV muskel afferenter i råtta EDL 11, Group Ia och II spindel afferenter på råtta fjärde lumbrical tå muskler 12 och grupp III och IV muskel afferenter i tHan mus plantar muskeln 13.
Ett in vitro-system har fördelarna med farmakologisk tillgänglighet och direkt kontroll perfusat och fysiokemiska variabler såsom temperatur och pH. En in vitro-metod eliminerar potential in vivo confounds av anestesi och muskel perfusion status. Medan muskelnerv förberedelse möjliggör studier av direkt respons av en störning på afferenter, förmågan att studera gamma efferenta modulering av spindel känslighet och andra integrerade lösningar som är möjligt med in vivo 14 eller ex vivo 3 preparat offras som det finns inga nervcellkroppar i denna beredning.
Detta preparat har tidigare använts för att karakterisera svaret av musen muskelspindel afferenter till ett batteri av ramp och håll sträckor och vibrationer, och det bestämdes att spindel mus afferenta responses liknade dem som rapporterats i andra arter såsom råttor, katter och människor. Mus spindel afferenta svar befanns vara liknande på både 24 ° C och 34 ° C badtemperaturer, men vid 34 ° C absolut bränning priser var snabbare och afferenter var mer kunna bemöta snabbare längdförändringar 15. Vi beskriver nedan hur detta preparat kan användas för att identifiera och studera de muskelspindel afferenter. Dessutom kan denna beredning lätt modifieras för att studera svaret av andra muskel afferenta subtyper 13, att jämföra egenskaperna hos sensoriska afferenter som svar på ett läkemedel eller sjukdomstillstånd eller diverse andra variabler (t.ex. ålder, kön, gen knockout).
Målet med denna artikel var att beskriva en metod för inspelning från muskelspindel afferenter i en isolerad mus muskel-nerv beredning. Vi har funnit att spindel musen afferenter reagerar på samma sträcka som de från råttor, katter och människor 15, och andra laboratorier har använt möss som modellorganismer för att studera sensoriska neuroner i både muskler och huden in vitro (t.ex. 3,13) .
Muskel sensoriska afferenter kan spelas in i minst 6-8 timmar vid både 24 ° C och 34 ° C. För att minimera hanteringen EDL och nerv, använda den återstående delen av FHL att hantera vävnad när det är möjligt. Efter dissektion, vänta minst 1 timme för att starta datainsamlingen för att låta vävnaden till jämvikt till badtemperatur och för normal synaptisk transmission att återhämta sig. Tidigare har muskelhälsa kontrolleras på en delmängd av muskler som används i denna beredning genom att bestämma att den maximala tetanic contractile kraft som genereras av musklerna är liknande den som rapporterats av andra vid början och slutet av experimentet 15.
Muskelspindel afferenter identifierades funktionellt i denna beredning genom att leta efter en karakteristisk paus i bränning som svar på rycka kontraktion (figur 2) samt de förväntade momentana frekvensen ökar som svar på förändringar längd (Figur 3). Vår erfarenhet är att de flesta afferenter att brand inom kontrollvillkoren muskelspindel afferenter. Längden på nerven kvar i denna beredning (~ mm max 7) är inte tillräckligt lång för att använda afferenta ledningshastighet skillnader för att identifiera muskel afferenta subtyper 13. Dessutom, till skillnad från katter och människor, åtgärder för dynamisk känslighet inte kunde tydligt skilja Group Ia och II afferenter i möss (för vidare diskussion se Wilkinson et al. 15). Andra subtyper av afferenter (dvs.., Grupp III och IV) kan identifieras med hjälp av ytterligare funktionstester i denna beredning, till exempel genom att lägga till ämnen som capsaicin, ATP eller bradykinin, sjunkande bad pH, utsätta muskeln till ischemi, etc. 3,13,21-23 Använda sug elektroder gör att aktiviteten från flera sensoriska nervceller som ska spelas in på en gång, vilket ökar mängden data som kan samlas in från en enda muskel. Detta preparat kan användas för att mäta den totala effekten av en störning på sensoriska neuron befolknings svar eller svaren från identifierade afferenter. Om spik former är unikt nog, upp till 4 sensoriska neuroner kan diskrimineras av programvara (både Spike2 (Cambridge Electronic Design) och LabChart Pro (AD Instruments) har utförts på liknande sätt). I de fall där nervceller inte kan diskrimineras, kan förändringar i elektrodplacering eller spetsdiameter lätt implementeras.
Sammanfattningsvis musen muskel-nerv in vitro preparation är en enkel experimentell metod som kan användas för att undersöka svarsegenskaper muskel sensoriska afferenta nerver till olika fysikalisk-kemiska störningar, skador och sjukdomsmodeller. Dessutom är denna beredning idealiskt lämpad för att dra fördel av de kraftfulla genetiska verktyg som finns i möss, inklusive transgena djur och optogenetic verktyg.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.
Force and Length Controller & Tissue Bath | Aurora Scientific, Inc. | 300C-LR & 809B-IV | |
Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump & Easy Load II Pump Head | Cole Parmer | EW-07523-80 & EW-77200-60 | |
2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier & Headstage Amplifier | A-M Systems | Model 1800; 700000 & 700500 | |
Simulator | Grass OR Aurora Scientific, Inc. |
S88 OR 701 C |
|
Dissecting Microscope | Swift | 892070 | |
Fiber Optic Light Source | Fiberlite | Model 190 | |
Analog to Digital Board | AD Instruments | PL3508/P (PowerLab 8/35) | |
Data Acquisition & Analysis Software | AD Instruments | LabChart Pro 7 | |
Electrode Holder | A-M Systems | 672445 | |
Electrode Glass | Dagan | SA16 | |
Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | P-80/PC | |
Microforge | Narishige | MF-9 | |
Isoflourane | MWI Veterinary Supply | 18627 | |
Surgical Tools | |||
Large Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14014-17 | |
Large Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
#5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
#55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sharp Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | |
6-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-50 | |
Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF (Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 ± 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 ± 0.05) |
|||
Sodium Chloride | Sigma | S9888-1KG | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Sigma | 230391-500G | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Sodium Gluconate | Sigma | S2054-500G | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282-500G | |
Glucose | Sigma | G5767-500G | |
Sucrose | Sigma | S5016-500G | |
HEPES | Sigma | H3375-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P0662-500G | |
Potassium Chloride | Sigma | P3911-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014-500G |