Summary

Propagation d'<em> Virus-01 Homalodisca coagulata</em> Par<em> Homalodisca vitripennis</em> Culture Cellulaire

Published: September 25, 2014
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole de propager les cellules de Homalodisca et HoCV-1 in vitro. Le milieu a été retiré de HoCV-1 et des cultures positives ARN extrait tous les 24 h pendant 168 h. Cellule de survie a été quantifiée par coloration au bleu trypan. Particules virales entières ont été extraits après l'infection. L'ARN extrait a été quantifiée par qRT-PCR.

Abstract

Le tireur vitreux ailé (Homalodisca vitripennis) est un insecte extrêmement polyphage et vagile trouvé dans tout le sud-ouest des États-Unis. Ces insectes sont les vecteurs prédominants de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), une bactérie du xylème limitée qui est l'agent causal de la maladie de Pierce (PD) de vigne. La maladie de Pierce est économiquement dommageable; Ainsi, H. vitripennis sont devenus une cible pour des stratégies de gestion de l'agent pathogène. Un dicistrovirus identifié comme virus-01 Homalodisca coagulata (HoCV-01) a été associée à une mortalité accrue chez H. populations vitripennis. En raison d'une cellule hôte est nécessaire pour la réplication HoCV-01, la culture de la cellule fournit un environnement uniforme pour la réplication qui est ciblé sur le plan logistique et une valeur économique pour la production de bio-pesticide. Dans cette étude, un système de propagation à grande échelle de H. vitripennis cellules via la culture de tissus a été développé, pournir un mécanisme de réplication virale. HoCV-01 a été extrait des insectes de tout le corps et utilisée pour inoculer H. culture vitripennis cellules à différents niveaux. Le milieu de culture a été prélevé toutes les 24 h pendant 168 heures, l'ARN extrait et analysé par qRT-PCR. Les cellules ont été colorées avec du bleu trypan et on les compte pour quantifier la survie des cellules en utilisant la microscopie optique. Particules virales entières ont été extraites jusqu'à 96 heures après l'infection, qui a été le point d'être déterminé avant l'effondrement total de culture cellulaire a eu lieu de temps. Les cellules ont été également soumis à coloration fluorescente et visualisés en utilisant la microscopie confocale pour étudier l'activité virale sur l'intégrité de l'attachement et des noyaux F-actine. La conclusion de cette étude est que H. cellules vitripennis sont capables d'être cultivées et utilisées pour la production de masse de HoCV-01 à un niveau approprié pour permettre la production d'un biopesticide.

Introduction

Le vitreux ailé tireur (Homalodisca vitripennis Germar 1821) a été identifié comme le vecteur principal de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), l'agent causal de la maladie de Pierce de la vigne (PD) en Amérique du Nord 1. Gestion des populations d'insectes est rapidement devenu le centre de recherche pour lutter contre ce problème dévastateur pour l'industrie de la viticulture en Californie et dans le sud des États-Unis. Un sens positif, virus à ARN simple brin appartenant à la famille Dicistroviridae, Homalodisca virus-01 coagulata (HoCV-01) a été identifié dans H. sauvage populations vitripennis et démontré que l'augmentation de la mortalité chez les populations de 2-4, tout en réduisant la résistance de l'insecte aux insecticides.

Développement de méthodes de manière efficace arrière infecté H. vitripennis à l'âge adulte dans un environnement de laboratoire ont été difficiles car <em> H. vitripennis ont des besoins nutritionnels spécifiques de stade qui nécessitent une grande variété de plantes hôtes 5-8. Installations spécifiques sont nécessaires pour H. direct arrière vitripennis aux États-Unis; Par conséquent, la culture cellulaire est plus économique et une alternative viable, ainsi que de plus en plus vital pour HoCV-01 détection et la réplication 2,9. Bien que les méthodes de base pour établir des cultures de cellules de H. vitripennis sont décrites, ces méthodes n'ont pas encore été utilisées pour la production commerciale d'agents de lutte biologique, tels que les virus 2.

L'objectif global des procédures suivantes est de produire une forte concentration de HoCV-01 convient pour une utilisation comme agent de lutte biologique. La réplication virale nécessite une cellule vivante, ce qui explique pourquoi cultiver avec succès et l'optimisation de H. vitripennis cultures est vitale pour le progrès de produire des niveaux rentables de virus.

Protocol

1 Culture Cellulaire REMARQUE: les lignées cellulaires de Homalodisca établies par le laboratoire Dr. Wayne Hunter au USDA Agricultural Research Service (Ft. Pierce, FL USA) ont été utilisés pour initier un stock de laboratoire composé de stades cellulaires mixtes incluant les fibroblastes initiales et monocouches. Effectuez les procédures suivantes dans un environnement de laboratoire stérile maintenue dans une plage de température de 20-24 ° C avec 25 cm …

Representative Results

attachement cellulaire et la croissance a été observée dans les 48 heures de passage dans les deux petites et grandes flacons de culture, de cultures primaires et les passages continus. la croissance des fibroblastes et le développement a également été observée dans ce laps de temps. Lorsque flacons nouvellement ensemencées ont été perturbés avant 48 h, il y avait un déclin visible dans la fixation des cellules, conduisant à des cultures à croissance plus lente et parfois pas de fixation ou de croissance …

Discussion

Préoccupations croissantes concernant l'introduction d'espèces invasives agricoles ont conduit à une demande accrue de nouvelles méthodes pour se défendre contre les ravageurs et agents pathogènes émergents. Un centre de prévention et de gestion de la maladie implique la gestion des vecteurs de pathogènes et était la cible principale de cette étude. Economie jouent un rôle essentiel dans la décision de produire ce type de biopesticide pour gérer les vecteurs de pathogènes dans l'agriculture pa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA  Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water
TRIzol LS  Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit  Qiagen 204243
4% paraformaldehyde  Sigma Aldrich P6148  Reagent grade, crystalline
PBS  Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100  Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin  Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI  Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System  Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10X) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1X) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1X) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100X) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50X) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ Glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

References

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Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

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