Ortotopisk Injektion af brystkræft celler i brystfedtpuden af ​​mus til at studere tumorvækst.

Summary

Cancer er en kompleks sygdom, der påvirkes af væv, der omgiver tumoren samt lokal pro- og anti-inflammatoriske mediatorer. Derfor kan orthotrope injektion modeller, snarere end subkutane modeller være nyttigt til at studere udviklingen af ​​kræft på en måde, der bedre efterligner human patologi.

Abstract

Brystkræft vækst kan studeres i mus ved anvendelse af en overflod af modeller. Genetisk manipulation af brystkræft celler kan give indsigt i funktionerne af proteiner involveret i onkogen progression eller hjælp til at opdage nye tumorsuppressorer. Desuden kan injicere kræftceller i mus med forskellige genotyper give en bedre forståelse af betydningen af ​​stromale rum. Mange modeller kan være nyttigt at undersøge visse aspekter af sygdomsprogression, men ikke rekapitulere hele kræft processen. I modsætning hertil brystcancerceller indpodning til brystfedtpuden af ​​mus bedre rekapitulerer placeringen af ​​sygdom og tilstedeværelsen af ​​det korrekte stromal rum og derfor bedre efterligner human cancersygdomsmodificerende. I denne artikel beskriver vi, hvordan at implantere brystkræftceller i mus orthotopisk og forklare, hvordan at indsamle væv til at analysere: 14px; line-højde:. 28px; "> tumor miljø og metastase til fjerne organer anvendelse af denne model, mange aspekter (vækst, angiogenese og metastase) af cancer kan undersøges ved blot at tilvejebringe en passende miljø for tumorceller at vokse.

Introduction

Kræft er en meget kompleks sygdom, der har været genstand for undersøgelser i over århundreder. Brystkræft er den mest almindelige cancertype; det forekommer overvejende hos kvinder, men kan sporadisk også forekomme hos mænd ^27. Sygdommen er primært forårsaget af tabet af styremekanismen ledelsesorgan celledeling, hvilket igen fører til en uendelig vækst af celler i kroppen. Disse fejl kan være forårsaget af flere mekanismer: første, raske celler brug vækstsignaler fra de omkringliggende celler for at formere henviser cancerceller gøre deres egne vækstfaktorer og øge ekspressionen af vækstfaktorreceptorer således at opnå en højere proliferationshastighed ^1; andet cancerceller er mindre modtagelige for anti-proliferative signaler ^8; tredje, at afbalancere celleantallet i kroppen celledød er også påkrævet; dog kræftceller flygte fra programmeret celledød, betegnet apoptosis ^14; fjerde adhærerer til ekstracellulære matricerfor at overleve, men tumorceller kan vokse uden behov for fastgørelse og viser modstand mod anoikis ^19; femte aktivering af telomerase omgår telomer afkortning og forhindrer den replikative ældning ^21; sidst men ikke mindst, springer DNA kvalitetskontrol af efterfølgende mitose resulterer i ændret genetisk indhold ^15,16. For at identificere onkogener eller tumorsuppressorer, der spiller en rolle i denne dereguleret spredning, tumor vækst eksperimenter i mus er afgørende.

Primær tumorvækst er generelt ikke den vigtigste årsag til dødsfald. Migration af cancerceller fra det primære sted til et andet sted, kaldes metastase, er den førende årsag til dødsfald i de fleste kræftpatienter ^22. Metastase indebærer tumorcelleinvasion, intravasation, rejser gennem cirkulationen, undgå immunangreb, ekstravasation og vækst på det sekundære site. Epitelial til mesenkymale overgang (EMT) er et centralt proces imetastase og indebærer et skift i genekspressionsprofiler giver celler med højere motilitet og invasivitet, som er forudsætninger for metastaserende cellen ^12. Da kræft proces er den resulterende af en kombination af forskellige foranstaltninger, herunder gensidige interaktioner mellem kræftceller, stromale celler og pro- og anti-inflammatoriske celler, en in vitro metode til kræft ofte ikke giver fuld indsigt i kræft proces. Tilsvarende anticancerbehandlinger påvirker tumorvaskulaturen kan ofte ikke undersøgt in vitro, således anvendelsen af in vivo fremgangsmåder er uundgåelig.

At studere brystkræft progression, er blevet udviklet forskellige eksperimentelle metoder. Den mest udbredte model er den subkutane injektion af brystcancerceller i mus ^5. I denne forsøgsopstilling kan investigator indføre en lang række ændringer af en cellelinje af valg in vitro (dvs.opregulering, nedregulering af proteiner) og injicere cellerne under huden. Selv om denne fremgangsmåde er ligetil og injektionsprocessen er enkel uden behov for at udføre kirurgi på mus, er det sted, hvor tumoren injiceres ikke repræsentere lokale brysttumor miljø og fraværet af dette miljø kan resultere i brystkræft udvikling, adskiller sig fra hvad der er observeret i human patologi. For det andet er gensplejsede mus anvendes ofte som et in vivo værktøj til at studere brystkræft progression. I denne model er onkogen (dvs. PyMT, Neu) ekspression drevet af en brystvæv-specifik promotor, der fører til dannelsen af spontan brysttumor s. Denne forsøgsopstilling er nyttigt at undersøge behandling aspekt af sygdommen ved at injicere lægemidler eller antistoffer under kontrol tumorstørrelse i tid ^3. Men avl af disse mus med andre musestammer deficiente eller muteret i et gen af ​​interesse kan også give insights i rollen af forskellige proteiner i brysttumorvækst ^24. Ulempen ved denne model er, at det er udsat for variation i tumor størrelse og antal. Desuden er niveauet af transgenekspression afhænger integration site i genomet, og kan skifte fra en musestamme til en anden ^4. I denne model, kan ekspressionen af transgenet opnås ved alle cellerne med epitel oprindelse henviser i human sygdom, kun en subpopulation af celler udtrykker onkogenet eller nedregulere tumor suppressor niveau ^26. At studere metastase, kan brystkræftceller også injiceres intravenøst ​​(en model kaldet eksperimentel metastase) ^25. Men denne fremgangsmåde kun rekapitulerer den metastatiske proces delvist; det omgår kravet om tumorceller til at invadere og intravasate og starter fra det punkt, hvor tumorceller er let til stede i kredsløbet.

I vores arbejde bruger vi en ortotopisk injicereion model til at studere inddragelse af gener af interesse i brystkræft progression ^13. Vi overudtrykker proteinet i humane brystkræftceller, og indsprøjtes i yverfedt pude af NOD / SCID gamma (NSG) mus. Denne metode er fordelagtig på mange måder: det giver meget hurtige og forskellige genetiske ændringer i det injicerede cellelinje, det dækker hele processen med brystkræft progression fra primær tumor vækst metastase på patologisk relevante steder, og det giver også en god forsøgsmodel for at studere virkningen af ​​terapeutiske behandlinger på tidlige eller sene stadier af sygdommen. Desuden kan ved hjælp af denne model en undersøge den rolle, stromale versus cancercellelinier afledte proteiner sygdomsprogression ved anvendelse af genetisk modificerede mus eller celler. Selv subkutane injektioner er lettere at udføre, ortotopisk modeller giver anledning til en mere tumorigen og mere metastatisk cancer cellepopulation. Således opnåede resultater ved hjælp af subkutan injektions kunne være enten falsk-negative eller falsk positive ^6,17 tilskynde til anvendelse af ortotopisk modeller til at studere tumorvækst.

Protocol

Dyreforsøg blev godkendt af dyrevelfærd udvalg i Leiden University Medical Center (LUMC). 1. Fremstilling af celler, Instrumenter og mus En dag før operation, barbere NOD / SCID gamma (NSG) mus fra den fjerde brystvorten med midterlinjen og afveje mus for at kontrollere, at alle mus har nogenlunde sammenlignelige vægte. Autoklaver en saks, to pincetter og to lige myg pincet (figur 1A). På dagen for operationen, vaske humant brystadenocarci…

Representative Results

Vellykket anvendelse af "ortotopisk brystkræft model" er baseret på en ordentlig indsprøjtning af celler i yverfedt pad. Eksperimentelle fejl som upræcise podning af celler eller lækage kan føre til variationer i tumorstørrelse eller fraværet af en tumor, som fører til dannelsen af en struktur ser ligner en brystfedtpude injiceret med en kontrol buffer (figur 2A). Den vækst af tumoren er afhængig af arten af den injicerede cellelinie og generelt kan iagttages gennem huden af mus <st…

Discussion

Orthotopisk injektion af brystcancerceller er en kraftfuld model til at undersøge alle aspekter af kræft vækst. Implantation af disse celler i brystfedtpuden af ​​musene bør udføres omhyggeligt for at undgå variation i tumorvækst. Vigtigst indsprøjte den samme mængde celler til hver mus er afgørende. For at gøre dette, bør man Trypsinisér cellerne strengt uden at påvirke cellernes levedygtighed. Bør der ses bort Ikke-levedygtige celler under celletælling og reagenser (dvs. trypanblåt), der …

Materials

Name of material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9