Orthotopic Injektion av bröstcancerceller i juverfett Pad av möss att studera tumörtillväxt.

Summary

Cancer är en komplex sjukdom som påverkas av den vävnad som omger tumören, liksom lokala pro- och anti-inflammatoriska mediatorer. Därför kan ortotropiska injektion modeller, snarare än subkutana modeller bör undersökas cancer progression på ett sätt som bättre efterliknar människo patologi.

Abstract

Bröstcancer tillväxt kan studeras i möss med användning av en uppsjö av modeller. Genetisk manipulering av bröstcancerceller kan ge insikter i de funktioner av proteiner involverade i onkogen progression eller hjälp att upptäcka nya tumörsuppressorer. Dessutom kan injicera cancerceller i möss med olika genotyper ge en bättre förståelse för vikten av stromal utrymmet. Många modeller kan vara användbara för att undersöka vissa aspekter av sjukdomsprogression men inte rekapitulera hela cancerprocessen. Däremot bröstcancerceller ympning till juverfett pad av möss bättre rekapitulerar platsen för sjukdomen och närvaro av rätt stromal utrymmet och därmed bättre efterliknar människans cancersjukdom. I den här artikeln beskriver vi hur man implantera bröstcancerceller i möss ortotopiskt och förklara hur man samlar vävnader att analysera: 14px; line-height:. 28px; "> tumörmiljö och metastasering till avlägsna organ Med hjälp av denna modell, många aspekter (tillväxt, angiogenes och metastasering) av cancer kan undersökas genom att helt enkelt ge en lämplig miljö för tumörceller att växa.

Introduction

Cancer är en mycket komplex sjukdom som har varit föremål för studier för över århundraden. Bröstcancer är den vanligaste typen av cancer; Det förekommer främst hos kvinnor, men kan sporadiskt också förekomma hos män ^27. Sjukdomen orsakas främst av förlust av styrmekanismen styrande celldelning vilket i sin tur leder till en oändlig tillväxt av celler i kroppen. Dessa felfunktioner kan orsakas av flera mekanismer: för det första, friska celler behöver tillväxtsignaler från de omgivande cellerna för att proliferera medan cancerceller göra sina egna tillväxtfaktorer och öka expressionen av tillväxtfaktorreceptorer sålunda erhålla en högre proliferativ hastighet ^1; andra, cancerceller är mindre känsliga för anti-proliferativa signaler ^8; tredje, för att balansera cellantalet i döden kroppscell krävs också; Men cancerceller fly från programmerad celldöd, benämnd apoptos ^14; fjärde, celler vidhäfta till extracellulära matriserför att överleva, men tumörceller kan växa utan behov av fäst och visa motstånd mot anoikis ^19; femte, aktivering av telomeras kringgår telomerförkortning och förhindrar replika senescens ^21; sist men inte minst, hoppa av DNA kvalitetskontroll efter mitos ger förändrad genetisk innehåll ^15,16. För att identifiera onkogener eller tumörsuppressorer som spelar en roll i denna avreglerade spridning, tumörtillväxt experiment på möss är avgörande.

Primär tumörtillväxt är i allmänhet inte den främsta orsaken till dödsfall. Migration av cancerceller från den primära platsen till en sekundär plats, kallas metastaser, är den ledande dödsorsaken i de flesta cancerpatienter ^22. Metastas innebär tumörcellinvasion, intravasering, reser genom cirkulationen, undvika immunattack, extravasering och tillväxt på den sekundära platsen. Epitelial till mesenkymala övergång (EMT) är en viktig processmetastaser och innebär en switch i genuttrycksprofilerna ger celler med högre motilitet och invasivitet, vilka är förutsättningarna för metastaserande cellen ^12. Som cancerprocessen är resultanten av en kombination av olika åtgärder, bland annat ömsesidiga interaktioner mellan cancerceller, stromaceller och pro- och antiinflammatoriska celler, en in vitro metod för cancer ofta inte ger full insyn i cancerprocessen. Likaså behandlingar mot cancer som påverkar tumörkärl ofta inte kan studeras in vitro, sålunda användning av in vivo närmar är oundviklig.

För att studera bröstcancer progression, har olika experimentella metoder utvecklats. Den mest använda modellen är den subkutana injektionen av bröstcancerceller i möss ^5. I denna experimentuppställning, kan utredaren införa ett brett spektrum av förändringar av en cellinje av val in vitro (dvs.uppreglering, nedreglering av proteiner) och injicera cellerna under huden. Även om denna metod är enkel och insprutningsprocessen är enkelt utan något behov av att utföra kirurgi på mössen, betyder det ställe vid vilket tumören injiceras inte representera den lokala brösttumörmiljö och frånvaron av denna miljö kan resultera i bröstcancerutveckling som skiljer sig från den som observerats hos människa patologi. För det andra är genetiskt manipulerade möss som ofta används som en in vivo-verktyg för att studera bröstcancer progression. I denna modell är onkogen (dvs pymt, Neu) uttryck som drivs av en bröstvävnadsspecifik promotor som leder till bildandet av spontan brösttumör s. Denna experimentuppställning är användbar för att studera behandlings aspekten av sjukdomen genom att injicera droger eller antikroppar vid kontroll tumörstorlek i tid ^3. Men uppfödning av dessa möss med andra musstammar bristfälliga eller muterade i en gen av intresse kan också ge insights in i rollen av olika proteiner i brösttumörtillväxt ^24. Nackdelen med denna modell är att den är benägen att variation i tumörstorlek och antal. Dessutom, graden av transgen expression beror på integrationsstället i genomet och kan förändras från en mus-stam till en annan ^4. I denna modell, kan expressionen av transgenen uppnås genom alla celler med epitelialt ursprung medan det i human sjukdom, endast en subpopulation av celler uttrycker onkogenen eller nedreglera de tumörundertryckande nivåerna ^26. För att studera metastaser, kan bröstcancerceller också injiceras intravenöst (en modell benämnd experimentell metastas) ^25. Men detta synsätt rekapitulerar bara den metastatiska processen delvis; det kringgår kravet för tumörceller att invadera och intravasate, och startar från den punkt vid vilken tumörcellerna är lätt närvarande i cirkulationen.

I vårt arbete använder vi en orthotopic injiceraion modell för att studera medverkan av gener av intresse för bröstcancer progression ^13. Vi överuttrycker proteinet i humana bröstcancerceller och spruta in dem i bröstfettkudden i NOD / SCID gamma (NSG) möss. Denna metod är fördelaktig på många sätt: det tillåter mycket snabba och diverse genetiska förändringar i den injicerade cellinje, täcker hela processen av bröstcancer progression från primärtumörtillväxt till metastaser vid patologiskt relevanta platser, och det ger också en bra experimentell modell för att studera effekterna av terapeutiska behandlingar i tidiga eller sena stadier av sjukdomen. Dessutom kan använda denna modell en undersöka vilken roll stromal kontra cancer-cellerna proteiner i sjukdomsprogression med hjälp av genetiskt modifierade möss eller celler. Fastän subkutana injektioner är lättare att utföra, orthotopic modeller ger upphov till en mer tumorogen och mer metastatisk cancer cellpopulationen. Sålunda erhållna resultat med hjälp av subkutan injektions kan vara antingen falskt negativa eller falskt positiva ^6,17 uppmuntra användningen av orthotopic modeller för att studera tumörtillväxt.

Protocol

Djurförsök har godkänts av djurskyddskommitté Leiden University Medical Center (LUMC). 1. Beredning av celler, Instrument och möss En dag före operationen, rakar NOD / SCID gamma (NSG) möss från fjärde bröstvårtan med mittlinjen och väger mössen att kontrollera att alla möss har ungefär jämförbara vikter. Autoklavera en sax, två pincetter och två raka mygga pincett (Figur 1A). På dagen för operationen, tvätta den mänsklig…

Representative Results

Framgångsrik tillämpning av "orthotopic bröstcancer modell" är baserad på riktig injektion av celler i bröstfettkudden. Experimentella fel såsom inexakt inokulering av celler eller läckage kan leda till variationer i tumörstorlek till och med avsaknaden av en tumör, som leder till bildningen av en struktur ser liknar en bröstfettkudden som injicerats med en kontrollbuffert (Figur 2A). Tillväxthastigheten av tumören är beroende på naturen hos den injicerade cellinjen och i allmä…

Discussion

Orthotopic injektion av bröstcancerceller är en kraftfull modell för att studera alla aspekter av cancertillväxt. Implantation av dessa celler i bröstfettkudden hos möss bör utföras noggrant för att förhindra variation i tumörtillväxt. Viktigast är avgörande att injicera samma mängd celler till varje mus. För att göra detta bör man trypsinize cellerna rigoröst utan att påverka livskraften hos cellerna. Icke-viabla celler bör bortses under cellräkning och reagenser (dvs trypanblått) som ka…

Materials

Name of material/equipment	Company	Catalog number	Comments/Description
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9