Induktion av Protein Strykning Genom<em> I Utero</em> Elektroporation att Definiera Underskott i neuronal migration i transgena modeller

Summary

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Abstract

Genetisk radering med Cre-Lox-systemet i transgena möss linjer är ett kraftfullt verktyg som används för att studera proteiners funktion. Men utom i mycket speciella Cre-modeller, leder radering av ett protein genom en vävnad eller cellpopulation ofta komplexa fenotyper följd av flera samverkande mekanismer. Fastställande av huruvida en fenotyp beror avbrott i en cell självständig mekanism, som är inneboende i cellen ifråga, eller från ett icke-cell självständig mekanism, som skulle bli följden av nedskrivning av den cellens omgivning, kan vara svåra att urskilja. För att få inblick i proteinfunktion i en in vivo sammanhang i livmodern elektroporering (IUE) möjliggör gendeletion i en liten delmängd av celler inom utvecklings cortex eller någon annan vald hjärnregion. IUE kan användas för att inrikta sig på specifika områden i hjärnan, inklusive rygg telencefalon, mediala telencephalon, hippocampus, eller ganglionär eminens. Detta underlättar observation of konsekvenserna av cell autonoma gendeletion inom ramen för en sund miljö. Målet med detta protokoll är att visa hur IUE kan användas för att analysera en defekt i radiell migration i en floxed transgen mus linje, med betoning på att skilja mellan de cell autonoma och icke-cells autonoma effekter av protein radering. Genom att jämföra fenotypen följd av gendeletion inom hela cortex kontra IUE-medierad gendeletion i en begränsad cellpopulation, större insikt i proteinfunktion i hjärnans utveckling kan uppnås än genom att använda antingen teknik i isolering.

Introduction

Radial migration är en central process för tidig kortikal utveckling. Det beror på en rad olika cell autonoma faktorer, såsom korrekt mitotiska exit och neuronal differentiering, cell polaritet, reglering av cytoskelettala dynamik och uttryck av transmembranreceptorer, såväl som icke-cell autonoma faktorer, såsom bildandet av den radiella gliaceller schavotten och utsöndring av flyttande vägledning molekyler ^1-3. Eftersom avbrott i någon av dessa mekanismer kan försämra neuronal migration i en transgen musmodell ^4-8, bestämma den underliggande orsaken till en defekt i migration kan vara en komplicerad och svår process. I livmodern elektroporering (IUE) kan användas för att komplettera och förenkla tolkning av fenotyp av en genetisk knock-out-modellen och därmed klarlägga viktiga mekanismer som krävs för radiell migration ^7,9-11.

I livmodern elektroporering (IUE) är den process genom vilken en plasmid carryi ng både en gen av intresse och en reporter injiceras i ventrikeln i hjärnan hos en mus eller råtta embryot och sedan dras in i cellerna som bekläder ventrikeln genom användning av en elektrisk ström ^{från 12 till 14.} Detta möjliggör för forskaren att analysera effekten av upp- eller nedreglering av en gen av intresse för utveckling eller funktion av electroporated neuroner. Efter IUE kan hjärnor behandlas för immunohistokemi ^7,9-11, elektrofysiologi ¹⁵ eller cellodling ^16,17. Den stora fördelen med IUE är som medger högspecifik manipulering av genuttryck. Vidare kan IUE användas för att rikta en särskild region i den växande hjärnan genom en riktad ström (Figur 2). IUE kan också användas för att rikta en specifik celltyp genom injektion av plasmider som bär gener under kontroll av olika promotorer eller plasmid aktiveringssystem (tetracyklin inducerad genuttryck är ett exempel) ^10,18-21.

jove_content "> IUE kan användas tillsammans med Cre-Lox medierad gen excision systemet ^7-9,11,22. En plasmid innehållande en gen som kodar meddelandet för Cre-proteinet kan elektroporation till ett embryo homozygot för floxade allelen ( , i vilken genen eller specifika DNA-regioner flankeras av två loxP-ställen för Cre-medierad DNA-rekombination). Cre kommer sedan framkalla rekombination av genen av intresse specifikt i elektroporerade neurala prekursorer, generering av en knock-out av floxed allele.The effekten av protein knockdown på neural migration och utveckling inom enskilda nervceller kan sedan studeras. Elektroporation av Cre inducerar rekombination i endast en liten population av drabbade cellerna och lämnar den stödjande miljön intakt. Däremot vävnadsspecifikt uttryck av Cre under kontroll av en celltyp specifik promotor, sker genom hela vävnaden så att både flyttande neuroblaster och omgivande miljö kan påverkas. Således Juxtaposition av dessa två metoder kan avgöra om en viss migration felet beror på cell autonoma eller cell icke-självständiga mekanismer. Defekt migration i både experimentella system tyder på att de observerade fenotyp resultaten från en cell självständig mekanism; normal migration efter elektroporering av Cre med defekt migrationen på ett vävnadsspecifikt Cre modell indikerar att genen av intresse agerar genom en icke-cell självständig mekanism.

IUE kan också användas för att utföra räddningsförsök genom electroporating potentiella samverkande gener i knock out djur ^7,9,10. Till exempel kan en utredare försöka rädda en migrations fenotyp i en transgen modell genom electroporating en nedströms mål och bestämma om migrations felet korrigeras i elektroporerade nervceller. Detta har den ytterligare fördelen att en framgångsrik räddnings indikerar att normal migration kan återställas genom att manipulera proteinuttryck i en specifik neuron, fastän den omgivande miljön är fortfarande bristfällig för den målsökta genen. Återigen, är detta synsätt mer tid och kostnadseffektivt än att korsa eller generera transgena linjer, med den extra fördelen att fastställa huruvida den defekta mekanismen är cell självständig.

IUE kan användas för att spåra migrera neuroner genom elektroporering av en reporter plasmid in knock out embryon (figur 4C). Eftersom endast de nervceller som kantar ventrikeln vid tiden för operationen är electroporated ^17, kan IUE användas för att följa nervceller föds vid en viss tidpunkt med fördelen av visualisering av deras morfologi in vivo.

Slutligen är det möjligt att använda IUE att rikta hjärnregioner som den mediala eller rygg telencefalon, hippocampus eller ganglionär eminens (Figur 2). Detta ger forskarna befogenhet att undersöka geners funktion i ett visst område oberoende av komplikationer resultateting från protein knockdown i grann strukturer.

Retinoblastomprotein (pRb), p107 och p130 omfattar fickan protein familjen och är väl etablerade regulatorer av cellcykeln exit. Men det finns allt fler bevis för att dessa proteiner reglerar även cellcykel oberoende aspekter av neurala utveckling. Som vi tidigare har visat, pRb och p107 spelar en avgörande roll i både tangentiell ^4,23 och radiell migration ^6. Här visar vi rollen av fickprotein familjemedlemmar pRb och p107 på neural migration ⁶ för att exemplifiera användningen av i livmodern elektroporering av Cre i en transgen modell. Sammanfattningsvis ger IUE ett kraftfullt sätt att analysera cell autonoma effekter av gendeletion (eller överuttryck). I kombination med vävnadsspecifika slå ut modeller, kan IUE ge ytterligare information om de mekanismer som styr neural migration.

Protocol

OBS: Alla experiment godkändes av University of Ottawa Djurvård etiska kommitté, som ansluter sig till riktlinjerna för den kanadensiska rådet om Animal Care. 1. Förhands kirurgiska Förberedelser och Material Plasmidberedning: Förbered plasmider använder Qiagen Megaprep enligt tillverkarens protokoll. Ympa minst 400 ml LB-buljong med transformerade bakterier för att säkerställa en hög DNA-utbyte och inkubera över natten. Resuspendera plasmid i 100-…

Representative Results

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo’s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (…

Discussion

Två av de viktigaste utmaningarna i att uppträda i livmodern electroporations är 1) förebygga embryoletalitet och 2) minska variationen mellan electroporations. En av de viktigaste faktorer för att förhindra dödlighet är nålen kvalitet, som trubbiga nålar fogar mer skada på embryot. Vid skärning av nålen, hålla spetsen så länge som möjligt samtidigt som man möjliggör en synlig droppe av 0,1-0,2 pl av vätska att framträda efter en pump av foten paddel (figur 1J). Om nålen ?…

Materials

Table 1: Equipment and Materials
Product Name	Company	Catalog Number		Description
ECM 830 Square Wave Electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0052		Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0211		Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm)		Platinum forcep style electrodes
Femtojet	Eppendorf	920010504		Microinjector
Griphead 0	Eppendorf	920007414		Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder	Eppendorf	920007392		Connects griphead to tube
Injection Tube	Eppendorf	920007431		Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control	Eppendorf	920005098		Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips	Eppendorf	930001007		Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit	Qiagen	12181		5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G		Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08		For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14084-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10		Straight
Colibri Retractors	Fine Science Tools	17000-03
Stapler	Fine Science Tools	12031-07		For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder	Medical Tools	SNH-6737		Straight, with lock
Needle Puller	Narishige	PC-10		For pulling microcappillaries
Microcapillaries	Drummond	1-000-800		0.4 mm inner diameter glass capillary tubes