रैपिड बैक्टीरियल पहचान और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए एक रक्त संस्कृति गोली की तैयारी
Summary
एक सकारात्मक रक्त संस्कृति से एक तेजी से बैक्टीरिया गोली तैयारी ऐसी MALDI-TOF द्वारा पहचान, ग्राम धुंधला, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण और पीसीआर आधारित परीक्षण के रूप में आवेदन के लिए एक नमूना के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. परिणाम तेजी से खून में संक्रमण से पीड़ित रोगियों के परिणाम में सुधार करने के लिए चिकित्सकों को सूचित किया जा सकता है.
Abstract
खून में संक्रमण और पूति रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण हैं. bacteremia से पीड़ित रोगियों का सफल परिणाम इष्टतम एंटीबायोटिक उपचार मार्गदर्शन करने के लिए संक्रामक एजेंट की एक तेजी से पहचान पर निर्भर करता है. सकारात्मक रक्त संस्कृति से ग्राम दाग का विश्लेषण तेजी से किया और पहले से ही काफी एंटीबायोटिक आहार को प्रभावित किया जा सकता है. हालांकि, संक्रामक एजेंट की सटीक पहचान अभी भी इष्टतम लक्षित उपचार की स्थापना के लिए आवश्यक है. हम यहां ऐसे डिस्क प्रसार परख द्वारा MALDI-TOF एमएस, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (AST) द्वारा पहचान या स्वचालित AST सिस्टम के रूप में कई आवश्यक बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एक नमूना के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सकारात्मक रक्त संस्कृति से एक सरल और तेजी से बैक्टीरिया गोली तैयारी पेश और स्वचालित द्वारा नैदानिक परीक्षण पीसीआर आधारित. रक्त संस्कृति बैक्टीरियल छर्रों पर सीधे लागू इन अलग पहचान और AST सिस्टम के प्रदर्शन को बहुत एसआई हैप्रदर्शन करने milar सामान्य रूप से अगर प्लेट पर हो अलग कालोनियों से प्राप्त की. परंपरागत तरीके की तुलना में, एक जीवाणु गोली का तेजी से अधिग्रहण काफी पहचान और AST दोनों रिपोर्ट करने के लिए समय कम कर देता है. इस प्रकार, निम्न रक्त संस्कृति सकारात्मकता, MALDI-TOF द्वारा पहचान 8 के भीतर क्रमशः 18 घंटा, स्वचालित AST सिस्टम या डिस्क प्रसार assays के द्वारा AST का परिणाम है जबकि कम से कम 1 घंटा के भीतर सूचित किया जा सकता है. इसी तरह, एक तेजी से पीसीआर आधारित परख के परिणामों चिकित्सकों के लिए एक bacteremia की रिपोर्ट के बाद कम से कम 2 घंटे भेजी जा सकती है. साथ में, इन परिणामों के एक रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली का तेजी से तैयारी की पहचान और AST वापसी समय पर और इस तरह खून में संक्रमण से पीड़ित रोगियों का सफल परिणाम पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि प्रदर्शित करता है.
Introduction
अस्पताल में भर्ती रोगियों में खून में संक्रमण और पूति रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण हैं. इस प्रकार, संक्रमण खून से संबंधित मृत्यु दर अस्पताल में भर्ती मरीज के 37% के बारे में 14% में मनाया जाता है और गहन देखभाल इकाइयों रोगियों 1-3 में 35% तक की वृद्धि हो सकती है. संक्रामक एजेंट की तेजी से पहचान इष्टतम रोगाणुरोधी उपचार मार्गदर्शन करने के लिए और रोगाणुरोधी चिकित्सा 4,5 के सफल परिणाम को बढ़ाने के लिए निर्णायक है. सकारात्मक रक्त संस्कृति से ग्राम दाग का तेजी से विश्लेषण पहले से ही रोगाणुरोधी चिकित्सा 6,7 लेकिन संक्रामक एजेंट की सटीक पहचान के अनुकूलन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है रोगियों को सर्वश्रेष्ठ रूपांतरित एंटीबायोटिक उपचार प्रदान करने के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, विभिन्न एंटीबायोटिक उपचार परहेज enterococci और ग्राम धुंधला द्वारा अंतर करना मुश्किल हो जाता है कि स्ट्रेप्टोकोक्की साथ bacteremia निम्नलिखित कार्यान्वित किया जाना है. इसी तरह, प्रजातियों पर पहचान लेवएल 8 lactams β के लिए एक बढ़ा प्रतिरोध प्रदान जो एक गुणसूत्र एएमपीसी जीन एन्कोडिंग ग्राम नकारात्मक enterobacteria का पता लगाने के लिए आवश्यक है.
एक सकारात्मक रक्त संस्कृति के साथ, पारंपरिक नैदानिक दृष्टिकोण जैव रासायनिक परीक्षण, विभिन्न चयनात्मक मीडिया पर विकास और स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली सहित विभिन्न दृष्टिकोण के साथ अतिरिक्त ऊष्मायन से पहले पहचान के कई घंटे की आवश्यकता है जो विभिन्न अगर प्लेटों पर संक्रामक एजेंट, उपसंस्कृति के लिए है. एक पारंपरिक नैदानिक दृष्टिकोण के परिणामों के समय के बारे में 1 से 3 दिन की है.
सूक्ष्मजीवों की तेजी से पहचान के लिए मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF) प्रौद्योगिकी के उद्भव जल्दी से सकारात्मक रक्त से सीधे भी अगर प्लेट पर हो कालोनियों से सूक्ष्मजीवों लेकिन पहचान करने के लिए एक नए उपकरण प्रदान की गई है संस्कृतियों (चित्रा 1) 9-12. गुरक्त संस्कृतियों से एक संक्रामक एजेंट की पहचान करने के लिए MALDI-TOF के ई उपयोग काफी कुछ मिनट के बजाय पारंपरिक तरीकों से आवश्यक घंटे और दिन के लिए परिणाम के लिए समय कम हो गया है. Croxatto एट अल. 13 से चर्चा की, MALDI-TOF पहचान की दक्षता सूक्ष्मजीव की पवित्रता और मात्रा सहित विभिन्न मापदंडों पर निर्भर करता है. इन दो मानदंडों को आसानी से अगर प्लेट पर हो असतत कालोनियों से प्राप्त लेकिन MALDI-TOF पहचान के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि कई सेलुलर और प्रोटीन घटक होते हैं जो रक्त संस्कृति के रूप में जटिल नमूने से जीवाणु संवर्धन और शुद्धि के लिए एक पूर्व विश्लेषणात्मक उपचार के लिए आवश्यक हैं.
रक्त संस्कृति से विभिन्न सूक्ष्मजीवों 'अलगाव तरीकों बैक्टीरियल निकासी 9,14, सीरम विभाजक विधि 10 के लिए सैपोनिन या अन्य हल्के डिटर्जेंट विधि सहित अध्ययन की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है, lysis centrifugation तरीकों 12 </sऊपर> और ऐसे sepsityper किट के रूप में व्यावसायिक रूप से समाधान. हमारे जीवाणु निदान प्रयोगशाला MALDI-TOF से बैक्टीरिया और खमीर की तेजी से पहचान और स्वचालित पहचान प्रणाली (चित्रा 2) 15 जो की अनुमति अमोनियम क्लोराइड एरिथ्रोसाइट-सेल पर आधारित एक साधारण रक्त संस्कृति बैक्टीरिया गोली तैयारी विकसित की है. यह रक्त संस्कृति गोली तैयारी भी ऐसी ग्राम धुंधला के रूप में अन्य प्रत्यक्ष बहाव के अनुप्रयोगों के लिए एक नमूना प्रदान करते हैं, इस तरह के मेथिसिलिन प्रतिरोधी Staphyloccocus ऑरियस का तेजी से पता लगाने (मरसा) के लिए POCT-PCRs, और साथ एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के रूप में स्वचालित पीसीआर आधारित नैदानिक परीक्षण स्वचालित AST सिस्टम और / या अगर प्लेट पर डिस्क प्रसार assays (चित्रा 3) के द्वारा.
Prod'hom एट अल द्वारा समझाया के रूप में इस काम में, हम खून संस्कृति बैक्टीरिया गोली की तैयारी के लिए विभिन्न चरणों का वर्णन. 15 (चित्रा 4). हम यह भी डे जाएगामुंशी रक्त संस्कृति गोली पर किया जा सकता है कि मुख्य आवेदन के तीन के लिए प्रोटोकॉल: स्वचालित Enterobacteriaceae के लिए सिस्टम 16 और staphylococci और स्वचालित PCR- साथ MALDI-TOF 15, पहचान (आईडी) और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (AST) द्वारा पहचान मरसा 17 का पता लगाने के लिए आधारित नैदानिक परीक्षण.
Protocol
Representative Results
Discussion
पारंपरिक सकारात्मक रक्त संस्कृति नैदानिक दृष्टिकोण की तुलना में, अमोनियम क्लोराइड सेल centrifugation के दृष्टिकोण का उपयोग कर एक जीवाणु गोली का तेजी से अधिग्रहण 24 घंटे और 48 घंटे के लिए 24 से AST रिपोर्ट करने के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रयोगशाला में तकनीकों को लागू करने के लिए उनकी मदद के लिए लुसाने विश्वविद्यालय अस्पताल केंद्र के जीवाणु विज्ञान प्रयोगशाला के तकनीशियनों को धन्यवाद.
Materials
| 20 needle gauge | Terumo, Leuven, Belgium | NN-2038R | |
| 50 ml Falcon tube | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 352070 | 50 ml centrifuge tubes |
| Ammonium chlorure | Merck, Darmstadt, Germany | 101145 | |
| Potassium hydrogen carbonate | Fluka, St. Louis, MO, USA | 60340 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507 | Flammable, corrosive |
| a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Fluka, St. Louis, MO, USA | 70990 | Acute toxicity |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 271004 | Flammable, acute toxicity |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508 | Corrosive, acute toxicity |
| Vitek 2 60 instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27202 | automated microbial system instrument |
| Vitek 2 Gram-positive (GP) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21342 | automated GP identification card |
| Vitek 2 AST-P580 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 22233 | automated microbial AST system |
| Vitek 2 Gram-negative (GN) card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 21341 | automated GN identification card |
| Vitek 2 AST-N242 card | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 413391 | automated microbial AST system |
| Xpert MRSA | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXMRSA-100N-10 | nucleic acid amplification technology MRSA |
| GeneXpert IV instrument | Cepheid, Sunnyvale, Ca, USA | GXIV-4-D | nucleic acid amplification technology instrument |
| Microflex LT MALDI-TOF MS instrument | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | BDAL microflex LT/SH | |
| MSP 96 target steel BC | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 280799 | MALDI target plate |
| Densitometer Densicheck instrument | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 27208 | |
| MALDI Sepsityper kit 50 | Bruker Daltonics, Bremen, Germany | 8270170 | |
| Mac Conkey agar | Biolife, Milano, Italy | 4016702 | |
| Mueller-Hinton agar | Oxoid, Hampshire, England | CM0337 | Mueller-Hinton agar (MH) |
| MHF agar | Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France | 43901 | Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF) |
| BD columbia III agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254071 | blood agar |
| BD chocolate agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254089 | chocolate agar |
| BD schaedler agar | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 254084 | Schaedler agar |
References
- Alberti, C., et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive care medicine. 28, 108-121 (2002).
- Angus, D. C., et al. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Critical care medicine. 29, 1303-1310 (2001).
- Vincent, J. L., et al. Sepsis in European intensive care units results of the SOAP study. Critical care medicine. 34, 344-353 (2006).
- Micek, S. T., et al. Empiric combination antibiotic therapy is associated with improved outcome against sepsis due to Gram-negative bacteria a retrospective analysis. Antimicrob Agents Chemother. 54, 1742-1748 (2010).
- Seifert, H. The clinical importance of microbiological findings in the diagnosis and management of bloodstream infections. Clin Infect Dis. 48, S238-S245 (2009).
- Barenfanger, J., et al. Decreased mortality associated with prompt Gram staining of blood cultures. American journal of clinical pathology. 130, 870-876 (2008).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J Clin Microbiol. 41, 495-497 (2003).
- Clerc, O., et al. Impact of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry on the clinical management of patients with Gram-negative bacteremia a prospective observational study. Clin Infect Dis. 56, 1101-1107 (2013).
- Meex, C., et al. Direct identification of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction. Journal of medical microbiology. 61, 1511-1516 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16, 1631-1638 (2010).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49, 543-551 (2009).
- Stevenson, L. G., Drake, S. K., Murray, P. R. Rapid identification of bacteria in positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 48, 444-447 (2010).
- Croxatto, A., Prod&34hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol Rev. 36, 380-407 (2012).
- Chen, J. H., et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry systems. J Clin Microbiol. 51, 1733-1739 (2013).
- Prod&34hom, G., Bizzini, A., Durussel, C., Bille, J., Greub, G. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets. J Clin Microbiol. 48, 1481-1483 (2010).
- Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system. Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).
- Clerc, O., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. , (2013).
- Martiny, D., et al. Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management. Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).
- Stoneking, L. R., et al. Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients. The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).
- Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).
