Isolering og dyrkning af dissocierede sensoriske neuroner Fra kyllingeembryoer

Summary

Cellekulturmodeller give detaljerede kontrol over miljøforhold og dermed give en stærk platform til at belyse mange aspekter af neuronal cellebiologi. Vi beskriver en hurtig, billig og pålidelig metode til at isolere, dissociere og kultur sensoriske neuroner fra kyllingefostre. Nærmere oplysninger om substrata forberedelse og immuncytokemi er også til rådighed.

Abstract

Neuroner er mangesidede celler, som bærer information afgørende for en bred vifte af funktioner, herunder fornemmelse, motorisk bevægelse, læring og hukommelse. At studere neuroner in vivo kan være en udfordring på grund af deres kompleksitet, deres varierede og dynamiske miljøer, og tekniske begrænsninger. Af disse grunde kan studere neuroner in vitro vise sig gavnlig at optrævle de komplekse mysterier neuroner. Den veldefineret karakter cellekulturmodeller giver detaljeret kontrol over miljøforhold og variabler. Her beskriver vi, hvordan du isolerer, dissociere og kultur primære neuroner fra kyllingefostre. Denne teknik er hurtig, billig, og genererer robust voksende sensoriske neuroner. Proceduren konsekvent fremstiller kulturer, der er stærkt beriget med neuroner og har meget få ikke-neuronale celler (mindre end 5%). Primære neuroner ikke klæber godt til ubehandlet glas eller vævskulturplast derfor detaljerede procedurer for at skabe to Distinct, er veldefinerede laminin-holdige substrater til neuronal plettering beskrevet. Kulturperler neuroner er meget modtagelig til flere cellulære og molekylære teknikker, herunder co-immunopræcipitation, levende celler forestille, RNAi, og immuncytokemi. Procedurer for dobbelt immunocytokemi på disse dyrkede neuroner er blevet optimeret og beskrevet her.

Introduction

Neuroner er komplekse celler, som bærer information afgørende for en bred vifte af funktioner, herunder fornemmelse, vision, motor bevægelse, læring og hukommelse. Unik fra andre celletyper neuroner strækker arm-lignende processer, kaldet axoner til dannelse af væsentlige neurale veje for kommunikation. Under udvikling specialiserede rum placeret på spidsen af ​​voksende axoner, kaldet vækstkegler, navigere gennem en koncert af ekstracellulære stikord til at lede Axon til dens korrekte destination. De indviklede molekylære mekanismer, der ligger til grund for vækst kegle navigation er ikke fuldt forstået. For bedre at forstå disse mekanismer, har forskere brugt cellekulturmodeller at studere neuroner i en defineret og forenklet in vitro-miljø. Studere neuroner i kultur ¹ har ført til betydelige fremskridt i vores forståelse af neuronal cellebiologi herunder: neuronal differentiering ^2, cytoskeletale dynamik, endocytose og menneskehandel, dendritcellerregulering ^3,4, axonal regenerering ^5, og kliniske tilstande, såsom neuropatier ^6. Desuden dyrkede neuroner er meget modtagelig for en bred vifte af forskning teknikker herunder immuncytokemi celleoverflade co-immunfældning, western blot, transfektion, RNAi og levende billeddannelse såsom Timelapse analyse af vækst kegle motilitet. Således dyrkning primære neuroner er en kraftfuld metode til at belyse mange aspekter af cellebiologi af neuroner.

Cellekulturen modellen giver efterforskerne med detaljeret kontrol over miljøforhold og variabler. For eksempel kan substrater, som neuroner udplades (og vokse på) nemt manipuleres. Her giver vi detaljerede instruktioner til at generere to særskilte substrater, den ene med en lav laminin-1-koncentration og den anden med mættende koncentrationer af laminin-1. Overraskende kan forskellige koncentrationer af det samme molekyle have dramatiske virkningerden indre tilstand af neuroner samt deres celleoverflade sammensætning. For eksempel intracellulære niveauer af cAMP og overflade niveauer af integriner er væsentligt forskellige i neuroner belagt på disse to substrater ^7,8. Yderligere undersøgelser har vist, at andre molekyler, herunder fibronectin og chondroitinsulfat-proteoglycaner, virkninger på ekspression af celleoverflademolekyler og neuronal motilitet ^7-11. Desuden opløselige molekyler, såsom neurotrophiner og neurotropins også påvirke sammensætningen cellemembranen og neuronal motilitet ^12-16 og kan være let og præcist manipuleres i en cellekultur-model.

Her beskriver vi metoder til at isolere og kultur dissocieret sensoriske neuroner fra kyllingefostre. Denne procedure er blevet anvendt til at foretage betydelige gennembrud i neurobiologi, herunder axon udvækst ^{5,7,8,10,11,16-21} og blev ændret fra en procedure, designet til at isolere gangliecellerne ^22. Der erflere fordele ved denne fremgangsmåde. Først mange funktioner i chick Dorsalrodsganglieceller (DRG) udvikling godt karakteriseret, herunder tidsrammen for fødslen, Axon udvidelse, og protein udtryk profiler ^2,23-28, hvilket giver en lærerig grundlag for at bygge oplysende in vitro forsøg. For det andet adskilles neuronkulturer tillader investigator mere direkte studere neuroner i forhold til alternative fremgangsmåder ved hjælp af intakte DRG-eksplantater (som indeholder neuroner og ikke-neuronale celler) og / eller blandede kulturer indeholdende både dissocierede neuroner og ikke-neuronale celler. For det tredje, den her beskrevne procedure er ligetil, billig og modtagelig for bachelorstuderende. Derfor kan denne teknik anvendes til forskning samt til undervisningsformål. Desuden bør mindre ændringer af denne protokol giver hurtig, højt udbytte oprensning af neuroner fra andre end DRG kilder. For eksempel kan denne procedure modificeres til at give neuronalt Enriched kulturer fra andre væv, såsom embryonale forhjernen eller rygmarven.

Immuncytokemi protokoller er blevet optimeret for disse dissocierede neuronale kulturer, og er beskrevet i detaljer her. Proceduren for dobbelt immuncytokemi mod neural celleadhæsionsmolekyle (NCAM) og β1-integriner er tilvejebragt. Data genereret fra disse immunocytokemiske metoder er blevet anvendt til at undersøge den rumlige mønster og intensitet af flere molekyler i dyrkede neuroner ^8,16.

Protocol

1. Coverslip Forberedelse: Acid Wash og bage Mindst 2 dage før dissektion (trin 2), begynder de følgende trin til at forberede dækglas. Udfør syrevasken trin for at fjerne olier og grundigt rene dækglas. Load dækglas i porcelæn holder, lodret positionerer dækglas og forhindrer dem i at røre hinanden. Sænk holderen og dækglas i glas histologi container fyldt med 2 M saltsyre (HCI). Alternativt, hvis indehaver porcelæn ikke er tilgængelig, spredt ~ 20 dækglas vandret for at dække bunden…

Representative Results

Protokollen beskrevet her giver efterforskerne til kultur en beriget population af dissocierede embryonale sensoriske neuroner med meget få (f.eks <5%) ikke-neuronale celler 7,8,10,16. Talrige DRG kan fås fra lumbosacral, thorax og livmoderhalskræft regioner. Afhængig af behov investigator kan DRG fra disse forskellige anatomiske regioner let isoleres. For eksempel viser figur 1 billeder af kyllingefosteret gennem forskellige stadier af dissektion med lumbale DRG fremhævet i …

Discussion

Her præsenterer vi detaljerede protokoller til isolering og dyrkning dissocieret sensoriske neuroner fra en kyllingeembryo. Denne procedure genererer en beriget population af håndfast voksende neuroner in vitro ^7,8,10,16. Talrige cellulære og molekylære teknikker kan anvendes på disse dyrkede neuroner, herunder immuncytokemi, der er beskrevet her. Denne protokol blev for nylig anvendt til kvantitativt at vurdere intensiteten af immunolabeled aktiverede integriner i sensoriske vækstkegler ^8…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036