Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür
Summary
Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.
Abstract
Nöronlar duyusunda, motor hareket, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır yönlü hücrelerdir. In vivo nöronlar okuyan nedeniyle karmaşıklığı, çeşitli ve dinamik ortamlarda ve teknik sınırlamalar zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, in vitro olarak nöronların okuyan nöronların karmaşık sırlarını çözmek için oldukça faydalı olabilir. Hücre kültürü modelleri arasında iyi tanımlanmış bir yapısı çevre koşulları ve değişkenler üzerinde detaylı bir kontrol sağlar. Burada, izole ayırmak ve civciv embriyolardan kültürü birincil nöronların nasıl açıklar. Bu teknik, hızlı, ucuz ve sağlam duyusal nöronlar büyüyen üretir. Prosedür, tutarlı bir şekilde yüksek nöronlar için zenginleştirilmiştir kültürleri üretmektedir ve çok az nöron olmayan hücreler (% 5'ten az) sahiptir. İlköğretim nöronların bu nedenle ayrıntılı prosedürler iki Distin oluşturmak için, işlenmemiş cam veya doku kültürü plastik iyi uymayanct, nöronal kaplama için iyi tanımlanmış laminin ihtiva katmanlarından açıklanmaktadır. Kültürlü nöronlar eş-immunoprecipitation, canlı hücre tahayyül, RNAİ'nin ve İmmünositokimya dahil olmak üzere birden hücresel ve moleküler teknikler, son derece elverişlidir. Bu kültürlü nöronlar çift İmmünositokimya için prosedürler optimize edilmiş ve burada tarif edilmiştir.
Introduction
Nöronlar hissi, görme, motor hareketinin, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır karmaşık hücrelerdir. Diğer hücre tiplerinden Benzersiz, nöronlar iletişim için gerekli nöral otoyolları oluşturmak için, kol-gibi süreçleri olarak adlandırılan aksonlar uzatmak. Büyüyen akson ucunda bulunan kalkınma uzmanlaşmış bölümlerinde sırasında, kendine uygun hedef akson yol dışı ipuçlarının bir konser gezinmek, büyüme konileri denir. Büyüme konisinin navigasyon altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Iyi bu mekanizmaları anlamak için, araştırmacılar tanımlanmış ve basitleştirilmiş vitro ortamda nöronların çalışma hücre kültürü modelleri kullandık. Nöronal farklılaşma 2, sitoskeletal dinamikleri, endositoz ve kaçakçılığı, dendrit: kültürü 1 okuyan nöronlar da dahil olmak üzere nöronal hücre biyolojisi anlayışımızda önemli ilerlemelere yol açmıştırdüzenleme 3,4, aksonal rejenerasyon 5, ve bu nöropatiler 6 gibi klinik durumlar. Buna ek olarak, kültürlü nöronlar İmmünositokimya, hücre yüzeyi ko-bağışıklık çökelti Western blot, transfeksiyon, RNAi, ve bu büyüme konisi motilite timelapse analizi de dahil olmak üzere canlı bir görüntüleme araştırma teknikleri geniş bir yüksek ölçüde uygundurlar. Bu nedenle, birincil kültür nöronları Nöronların hücre biyolojisi çok yönlerini açıklamak için güçlü bir yaklaşım.
Hücre kültürü modeli çevresel koşullar ve değişkenler üzerinde ayrıntılı kontrol ile araştırmacılar sağlar. Örneğin, kaplama nöronlar (ve buna uygun olarak büyür) edildiği katmanlarından kolayca manipüle edilebilir. Burada, iki farklı katmanlarından, düşük laminin-1 konsantrasyonu ile bir ve laminin-1 konsantrasyonları doyurarak ile diğer üretmek için ayrıntılı talimatlar sağlar. Şaşırtıcı bir şekilde, aynı molekülün farklı konsantrasyonlarda istenmeyen etkilere sahip olabilirİç nöronların durumu yanı sıra hücre yüzeyi bileşime. Örneğin, integrinler, cAMP ve yüzey düzeyleri hücre içi düzeyleri, bu iki substrat üzerine kaplanır 7,8 nöronlarında önemli ölçüde farklıdır. Daha başka çalışmalarda, fibronektin ve kondroitin sülfat proteoglikan, etki hücre yüzey moleküllerinin ifade edilmesi ve nöronal motilite 7-11 de dahil olmak üzere, bu diğer molekülleri göstermiştir. Buna ek olarak, aynı zamanda, hücre zarı bileşim ve nöronal motilite 12-16 darbe ve kolay ve hassas bir hücre kültürü modeli olarak manipüle olabilir nörotrofin ve neurotropins gibi çözünebilir moleküllerdir.
Burada, biz yöntemleri izole etmek ve kültür civciv embriyoları duyusal nöronlar ayrışmış açıklar. Bu prosedür, akson büyümesinin 5,7,8,10,11,16-21 içeren nörobiyolojisinde önemli gelişmelere yapmak için kullanılmıştır ve gangliyon hücreleri 22 izole etmek için tasarlandı bir prosedürden modifiye edilmiştir. VarBu yaklaşımın birçok avantajları. İlk olarak, civciv sırt kök ganglion (DRG) gelişimi birçok özellikleri iyi doğum, akson uzantısı için zaman çerçevesi de dahil olmak üzere karakterize edilir, ve protein ifadesi böylece in vitro deneylerde bilgilendirici inşa etmek için bir öğretici temel sağlayarak, 2,23-28 profiller. İkinci olarak, nöronal kültürler araştırıcı daha doğrudan ayrışan nöronlar ve nöronal olmayan hücreler her ikisini ihtiva eden (nöronlar ve nöronal-olmayan hücreleri içeren) Bozulmamış DRG eksplantları ve / veya karışık kültürlerinin kullanıldığı alternatif yaklaşımlara kıyasla nöronların çalışma sağlar ayrışmış. Üçüncü olarak, burada açıklanan prosedür, basit, ucuz ve lisans elverişlidir. Bu nedenle, bu teknik araştırma hem de eğitim amaçlı kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol küçük varyasyonlar DRG'ler dışındaki kaynaklardan nöronların hızlı, yüksek verim arınma izin vermelidir. Örneğin, bu prosedür, ENR nöronal olarak temin etmek üzere modifiye edilebilirembriyonik önbeyinde omurilik gibi diğer dokulardan iched kültürler.
İmmünositokimya, bu protokoller ayrışan nöronal kültürler için optimize edilmiştir ve burada ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Nöral hücre adhezyon molekülü (NCAM) ve β1 integrinler karşı iki İmmünositokimya için prosedür sağlanır. Bu imüno yöntemlerle üretilen veriler kültüre edilmiş nöronlarda 8,16 uzaysal ve model oluşturmanın çok molekül yoğunluğunu incelemek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada izole etmek için ayrıntılı protokoller sunmak ve kültür bir civciv embriyo duyusal nöronlar ayrışmış. Bu prosedür vitro 7,8,10,16 yılında güçlü büyüyen nöronların zenginleştirilmiş bir nüfusu oluşturur. Çok sayıda hücresel ve moleküler teknikler burada açıklanan İmmünositokimya, aşağıdakileri içeren, bu kültüre edilmiş nöronlarda, uygulanabilir. Bu protokol, yakın zamanda nicel olarak duyu büyüme konilerinin 8,16 olarak imüno-akt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu kağıt üzerinde anlayışlı yorumlar için Alison Philbrook, Belinda Barbagallo ve Michael Francis teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma MLL layık bir R15 ALAN ödül 1R15NS070172-01A1 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| sterile small culture dishes (35mm) | Corning | 430165 | |
| sterile large culture dishes (100mm) | Falcon | 353003 | |
| sterile large petri dishes (100mm) | VWR | 89000-302 | |
| glass petri dish (100mm) | VWR | D108962 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| coverslips (22×22) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media |
| HCL | VWR | VW3204-1 | use at 2M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul |
| 15 ml conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10X | Gibco | 14200 | used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water |
| PBS 10X | Gibco | 14080 | used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM |
| Penicillin streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5mls in 500mls of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C non-defrosting freezer |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C, use 100ul per 10ml of F12H media |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| l-glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37 degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated beta 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Seconday Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 |
References
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
