Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür
Bu makalede
Özet
Özet
Nöronlar duyusunda, motor hareket, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır yönlü hücrelerdir. In vivo nöronlar okuyan nedeniyle karmaşıklığı, çeşitli ve dinamik ortamlarda ve teknik sınırlamalar zor olabilir. Bu nedenlerden dolayı, in vitro olarak nöronların okuyan nöronların karmaşık sırlarını çözmek için oldukça faydalı olabilir. Hücre kültürü modelleri arasında iyi tanımlanmış bir yapısı çevre koşulları ve değişkenler üzerinde detaylı bir kontrol sağlar. Burada, izole ayırmak ve civciv embriyolardan kültürü birincil nöronların nasıl açıklar. Bu teknik, hızlı, ucuz ve sağlam duyusal nöronlar büyüyen üretir. Prosedür, tutarlı bir şekilde yüksek nöronlar için zenginleştirilmiştir kültürleri üretmektedir ve çok az nöron olmayan hücreler (% 5'ten az) sahiptir. İlköğretim nöronların bu nedenle ayrıntılı prosedürler iki Distin oluşturmak için, işlenmemiş cam veya doku kültürü plastik iyi uymayanct, nöronal kaplama için iyi tanımlanmış laminin ihtiva katmanlarından açıklanmaktadır. Kültürlü nöronlar eş-immunoprecipitation, canlı hücre tahayyül, RNAİ'nin ve İmmünositokimya dahil olmak üzere birden hücresel ve moleküler teknikler, son derece elverişlidir. Bu kültürlü nöronlar çift İmmünositokimya için prosedürler optimize edilmiş ve burada tarif edilmiştir.
Giriş
Nöronlar hissi, görme, motor hareketinin, öğrenme ve bellek dahil, çeşitli işlevler için gerekli bilgiyi taşır karmaşık hücrelerdir. Diğer hücre tiplerinden Benzersiz, nöronlar iletişim için gerekli nöral otoyolları oluşturmak için, kol-gibi süreçleri olarak adlandırılan aksonlar uzatmak. Büyüyen akson ucunda bulunan kalkınma uzmanlaşmış bölümlerinde sırasında, kendine uygun hedef akson yol dışı ipuçlarının bir konser gezinmek, büyüme konileri denir. Büyüme konisinin navigasyon altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmış değildir. Iyi bu mekanizmaları anlamak için, araştırmacılar tanımlanmış ve basitleştirilmiş vitro ortamda ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Coverslip Hazırlanışı: Asit Yıkama ve pişirin
- En az 2 gün önce Diseksiyon (aşama 2) için, lamelleri hazırlamak için aşağıdaki adımları başlar. Yağlar ve tamamen temiz lamelleri kaldırmak için asit yıkama aşamasını gerçekleştirir.
- Dikey lamelleri pozisyonları ve birbirlerine dokunmadan onları engelleyen porselen tutucu Yük lamelleri. 2 M hidroklorik asit (HCI) ile dolu bir cam kap içine histoloji tutucu ve lamelleri batırılır. Porselen tutucu mevcut değilse, alternatif olarak, 100 mm cam Petri kabı alt kapağı ve 2 M HCl lamelleri daldırın 20 lamelleri yatay ~ yayıldı.
- Bir çeker ocak içinde külbütör tablasına (asit içinde daldırılmış l....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan protokol kültürü için çok az (örneğin, <5%) nöronal olmayan hücrelerin 7,8,10,16 ile ayrışan embriyonik duyu nöronlarının zenginleştirilmiş bir popülasyonu araştırmacılar sağlar. Sayısız DRG'ler lumbosakral, torakal ve servikal bölgelerde elde edilebilir. Araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak, bu farklı anatomik bölgelerden DRG'ler kolaylıkla izole edilebilir. Örneğin, Şekil 1 Şekil 1C ve 1D ve Şekiller 1E ve 1F
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada izole etmek için ayrıntılı protokoller sunmak ve kültür bir civciv embriyo duyusal nöronlar ayrışmış. Bu prosedür vitro 7,8,10,16 yılında güçlü büyüyen nöronların zenginleştirilmiş bir nüfusu oluşturur. Çok sayıda hücresel ve moleküler teknikler burada açıklanan İmmünositokimya, aşağıdakileri içeren, bu kültüre edilmiş nöronlarda, uygulanabilir. Bu protokol, yakın zamanda nicel olarak duyu büyüme konilerinin 8,16 olarak imüno-aktif integrinlerin yoğunluğunu değerlendirmek i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz bu kağıt üzerinde anlayışlı yorumlar için Alison Philbrook, Belinda Barbagallo ve Michael Francis teşekkür etmek istiyorum. Bu yayında bildirilen Araştırma MLL layık bir R15 ALAN ödül 1R15NS070172-01A1 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Birincil Antikor Tablosu
, , alikotunda 10 ng / ml'lik son konsantrasyonda kullanılır alikotunda 200 mM nihai konsantrasyonda kullanınfiksatif çözeltide kullanılan td colspan="4">
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Steril küçük kültür kapları (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Steril büyük kültür kapları (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Steril büyük Petri kapları (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Cam Petri kabı (100 mm) | VWR | D108962 | |
| İnce forseps | Güzel Bilim Araçları | 11251-10 | |
| Standart forseps | Güzel Bilim Araçları | 1100-12 | |
| Lameller (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm kalınlık mikroskopi için idealdir |
| Porcelin lamel tutucu | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Sığır serumu | Gibco | 17502-048 | 500 ml Ham F12 ortamı başına 50 ml alikot kullanın |
| HCl | VWR | VW3204-1 | 2 M'de kullanın, NaCl'yi atmadan önce iki kez kullanılabilir |
| Sigma | S9888, | laminin-1 stok çözeltisi için 5 M NaCl çözeltisi kullanın | |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | 72 ve mikro ekleyin; l steril 5 M NaCl ve 50 & mikro'ya alikot; l |
| 15 ml Konik tüp | hücre tedavisi | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | 1x'te kullanılır, steril Millipore filtrelenmiş su ile seyreltin |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | 1x'te kullanılır, steril Millipore filtrelenmiş su ile seyreltin |
| Jamb's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Sığır Serum Albümini (BSA) | Gibco | 10438 | % 10'da F12HS20 olarak kullanın |
| HEPES | Sigma | H3375 | damıtılmış suda steril 1 M çözelti yapın, 10 mM Penisilin / streptomyosin nihai konsantrasyonunu elde etmek için F12 ortamında seyreltin |
| Sigma | P0781 | 500 ml F12 ortamında 5 ml kullanın | |
| NT3 | Kırlangıç GF031 | 1 ml steril Millipore su ekleyin, steril koşullar altında alikot, -20 ° C'de saklayın; C, F12H ortamında 10 ng / ml nihai konsantrasyonda kullanın, -20 ° C'de tutun; C buz çözmeyen dondurucu | |
| NGF | RnD sistemleri | 256-GF | %0,1 BSA içeren 1 ml steril 1x PBS ekleyin, steril koşullar altında alikot, -20 ° C'de saklayın; C, steril koşullar altında F12H ortamı |
| L-Glutamin | Sigma | G7513 | , -20 ° C'de saklayın; C, steril koşullar altında F12H ortamında |
| Trypsin | Sigma | T4049 | , -20 ° C'de saklayın; C |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Gerekli diğer öğeler: cam Pasteur pipetleri, verimli beyaz leghorn tavuk yumurtası, yumurta kuluçka makinesini kontrol edin (nemlendirilmiş, 37 &°; C), hücre inkübasyon odası (nemlendirilmiş, 37 &°C; C), laminer akış başlığı, binoküler stereovizyon diseksiyon kapsamı | |||
| İmmünositokimya Reaktifleri Tablosu | |||
| sükroz | Sigma | S9378 | (% 4 paraformaldehi,% 30 sükroz, 2x PBS) Fiksatif çözeltide kullanılan |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehit | Sigma | P6148 | (% 4 paraformaldehit,% 30) sükroz, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal keçi serumu | Yaşam teknolojileri | PCN500 | |
| Mikroskop slaytları | VWR | 16004-430< | |
| NCAM'a karşı antikor | Millipore | AB5032 | poliklonal |
| Antikoru etkinleştirilmiş ve beta; 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoklonal |
| İkincil Antikor Tablosu | |||
| Goat anti-fare IgG Alexa 488 | Yaşam teknolojileri | A11001 | |
| Keçi anti-tavşan IgG Alexa 548 | Yaşam teknolojileri | A11036 |
Kaynaklar
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
