Isolering och odling av dissocierade sensoriska neuroner från kycklingembryon

Summary

Cellodlingsmodeller ger detaljerad kontroll över miljöförhållanden och därmed ge en kraftfull plattform för att belysa många aspekter av neuronal cellbiologi. Vi beskriver en snabb, billig och tillförlitlig metod för att isolera, dissocierar, och kultur sensoriska neuroner från kycklingembryon. Uppgifter om substrat förberedelse och immunocytokemi finns också.

Abstract

Nervceller är mångfacetterade celler som bär information som är väsentlig för en mängd olika funktioner, inklusive sensation, motor rörelse, inlärning och minne. Att studera nervceller in vivo kan vara en utmaning på grund av sin komplexitet, sin varierade och dynamiska miljöer, och tekniska begränsningar. Av dessa skäl kan studera nervceller in vitro vara till nytta för att lösa de komplexa mysterier nervceller. Den väldefinierad karaktär cellodlingsmodeller ger detaljerad kontroll över miljöförhållanden och variabler. Här beskriver vi hur man isolera, separera och kultur primära neuroner från kycklingembryon. Denna teknik är snabbt, billigt och alstrar kraftigt växande sensoriska neuroner. Förfarandet genomgående producerar kulturer som är högt anrikade för neuroner och har mycket få icke-neuronala celler (mindre än 5%). Primära nervceller fäster inte bra på obehandlat glas eller vävnadsodlingsplast, därför detaljerade förfaranden för att skapa två Distinct, väldefinierade laminin-innehållande substrat för neuronal plätering beskrivs. Odlade nervceller är mycket mottagliga för flera cellulära och molekylära tekniker, inklusive co-immunoprecipitation, levande cell fantisera, RNAi, och immunocytokemi. Rutiner för dubbel immuncytokemi om dessa odlade nervceller har optimerats och beskrivs här.

Introduction

Nervceller är komplexa celler som bär information som är väsentlig för en mängd olika funktioner, inklusive känsla, syn, motor rörelse, inlärning och minne. Unikt från andra celltyper, neuroner sträcker armliknande processer, kallade axoner, för att bilda eter neurala motorvägar för kommunikation. Under utvecklings specialiserade fack placerade vid spetsarna på växande axoner, som kallas tillväxt kottar, navigera genom en konsert av extracellulära signaler att leda axonet till dess rätt destination. De intrikata molekylära mekanismer som ligger bakom tillväxten konen navigation är inte helt klarlagda. För att bättre förstå dessa mekanismer har forskare använt cellodlingsmodeller för att studera nervceller i en definierad och förenklad in vitro miljö. Studera nervceller i kultur ¹ har lett till betydande framsteg i vår förståelse av neuronal cellbiologi inklusive: neuronal differentiering ^2, cytoskelettala dynamik, endocytos och människohandel, dendritereglering ^3,4, axonal regenerering ⁵ och kliniska tillstånd såsom neuropatier ^6. Dessutom odlade nervceller är mycket mottagliga för en rad olika forskningsmetoder inklusive immuncytokemi, cellytan co-immunoprecipitation, Western blot, transfektion, RNAi, och levande avbildning som Timelapse analys av tillväxten konen motilitet. Således odling primära neuroner är en kraftfull metod för att belysa många aspekter av cellbiologi av nervceller.

Den cellodlingsmodell ger utredare med detaljerade kontroll över miljöförhållanden och variabler. Till exempel kan det substrat som nervceller pläterade (och växa på) lätt manipuleras. Här ger vi detaljerade instruktioner för att generera två olika substrat, en med en låg laminin-1 koncentrationen och den andra med mättande koncentrationer av laminin-1. Överraskande, kan olika koncentrationer av samma molekyl har dramatiska effekterpå det interna tillståndet av neuroner liksom deras cellyta kompositionen. Exempelvis intracellulära nivåer av cAMP och yta nivåer integriner är signifikant olika i nervceller pläterade på dessa två substrat ^7,8. Ytterligare studier har visat att andra molekyler inklusive fibronektin och kondroitinsulfatproteoglykaner, inverkan uttrycket av cellytmolekyler och neuronal motilitet ^7-11. Dessutom lösliga molekyler såsom neurotrofiner och neurotropins också påverka cellmembransammansättning och neuronal motilitet ^12-16 och kan enkelt och noggrant manipuleras i en cellodlingsmodell.

Här beskriver vi metoder för att isolera och kultur dissocierade sensoriska neuroner från kycklingembryon. Detta förfarande har använts för att göra betydande genombrott i neurobiologi, inklusive axon utväxt ^{5,7,8,10,11,16-21} och modifierades från ett förfarande som syftar till att isolera ganglieceller ^22. Det finnsflera fördelar med detta tillvägagångssätt. Först många funktioner i chick dorsalrotganglia (DRG) utveckling väl karakteriserade inklusive tidsramen för födelse, axon förlängning, och proteinuttryck profiler ^2,23-28, vilket ger en lärorik grund att bygga informativa in vitro experiment. För det andra, dissocierade neuronala kulturer möjliggöra för forskaren att mer direkt studera neuroner jämfört med alternativa tillvägagångssätt som utnyttjar intakta DRG-explantat (som innehåller neuroner och icke-neuronala celler) och / eller blandade kulturer innehållande både dissocierade neuroner och icke-neuronala celler. För det tredje är det förfarande som beskrivs här okomplicerat, billigt och mottaglig för studenter. Därför kan denna teknik användas för forskning och för undervisningsändamål. Dessutom bör mindre ändringar av detta protokoll tillåter snabb, hög avkastning rening av nervceller från andra än DRG källor. Till exempel kan detta förfarande modifieras för att ge neuronalt Enriched kulturer från andra vävnader såsom embryonala framhjärnan eller ryggmärgen.

Immuncytokemi protokoll har optimerats för dessa dissocierade neuronala kulturer och beskrivs i detalj här. Förfarandet för dubbla immunocytokemi mot neural celladhesionsmolekyl (NCAM) och β1 integriner tillhandahålls. Data som genereras från dessa immunocytokemiska metoder har använts för att undersöka den rumsliga mönstring och intensiteten av flera molekyler i odlade nervceller ^8,16.

Protocol

1 Cover Förberedelser: Acid Wash och baka Minst 2 dagar före dissektion (steg 2), börjar följande steg för att förbereda täckglas. Utför syratvättsteg för att avlägsna oljor och rengör täck. Lasttäckglas i porslin hållare som vertikalt positionerar täck och hindrar dem från att röra varandra. Sänk hållaren och täckglas i glas histologi behållare fylld med 2 M saltsyra (HCl). Alternativt, om porslinshållare inte är tillgänglig, sprida ~ 20 täckhorisontellt för att täcka bo…

Representative Results

Protokollet som beskrivs här möjliggör utredare till kultur en berikad population av dissocierade embryonala sensoriska neuroner med mycket få (t.ex. <5%) icke-neuronala celler 7,8,10,16. Många DRG kan erhållas från lumbosakrala, bröstkorg och livmoderhalscancer regionerna. Beroende på behoven hos utredaren, kan DRG från dessa olika anatomiska regioner lätt isoleras. Exempelvis Figur 1 visar bilder av kycklingembryo genom olika stadier av dissektion med ländryggen DRG …

Discussion

Här presenterar vi detaljerade protokoll för isolering och odling dissocierade sensoriska neuroner från ett kycklingembryo. Detta förfarande ger en berikad population av kraftigt växande nervceller in vitro ^7,8,10,16. Många cellulära och molekylära tekniker kan tillämpas på dessa odlade nervceller, inklusive immuncytokemi, som beskrivs här. Detta protokoll användes nyligen för att kvantitativt bedöma intensiteten i immunolabeled aktiverade integriner i sensoriska tillväxt kottar ^8…

Materials

sterile small culture dishes (35mm)	Corning	430165
sterile large culture dishes (100mm)	Falcon	353003
sterile large petri dishes (100mm)	VWR	89000-302
glass petri dish (100mm)	VWR	D108962
fine forceps	Fine Science Tools	11251-10
standard forceps	Fine Science Tools	1100-12
coverslips  (22×22)	Fisher	12 518 105K	0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy
porcelin coverslip holder	Thomas scientific	8542E40
Fetal Bovine serum	Gibco	17502-048	use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media
HCL	VWR	VW3204-1	use at 2M, can be used twice before discarding
NaCl	Sigma	S9888	use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution
laminin-1	Invitrogen	23017-015	Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul
15 ml conical tube	cell treat	229411
PBS CMF 10X	Gibco	14200	used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water
PBS 10X	Gibco	14080	used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water
Ham's F12	Lonza	12-615F
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	10438	use in F12HS20 at 10%
HEPES	Sigma	H3375	make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM
Penicillin streptomyocin	Sigma	P0781	use 5mls in 500mls of F12 media
NT3	Millipore	GF031	Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C  non-defrosting freezer
N2	Invitrogen	17502048	aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C,  use 100ul per 10ml of F12H media
NGF	RnD systems	256-GF	Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media
l-glutamine	Sigma	G7513	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media
Trypsin	Sigma	T4049	aliquot under sterile conditions, store at -20 0C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Gibco	15260
Other items needed:  general dissection instruments, including  glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37  degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope
Immunocytochemistry Reagents Table
Sucrose	Sigma	S9378	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Triton-X 100	Sigma	T-8787
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS)
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
normal goat serum	Life technologies	PCN500
microscope slides	VWR	16004-430
Primary Antibody Table
Antibody against NCAM	Millipore	AB5032	polyclonal
Antibody against activated beta 1 ingegrin	Millipore	MAB19294	monoclonal
Seconday Antibody Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488	Life technologies	A11001
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548	Life technologies	A11036