Enkelt Plane Illumination Module og Micro-kapillær Approach for en Wide-field Microscope
Summary
En modul for enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) er beskrevet som lett kan tilpasses til en invertert bredt felt mikroskop og optimalisert for tre-dimensjonale cellekulturer. Prøven blir plassert i en rektangulær kapillar, og via en microfluidic system fluorescerende fargestoffer, kan farmasøytiske midler eller legemidler anvendes i små mengder.
Abstract
En modul for lys ark eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) er beskrevet som lett kan tilpasses til en invertert bredt felt mikroskop og optimalisert for tre-dimensjonale cellekulturer, f.eks, multi-cellulære tumor sfæroider (MCTS). De SPIM eksitasjon modul former og avbøyer lyset slik at prøven belyses av en lys arket perpendikulært på deteksjon bane av mikroskopet. Systemet er karakterisert ved bruk av en rektangulær kapillar for holding (og i en avansert versjon også av en mikro-kapillær tilnærming for roterende) prøvene, etter synkron innstilling av opplysnings-lyset er arket og objektiv-linsen som brukes for fluorescensdeteksjon samt ved tilpasning av en mikrofluidsystem for anvendelse av fluorescerende fargestoffer, farmasøytiske stoffer eller droger i små mengder. En protokoll for å arbeide med dette systemet er gitt, og noen tekniske detaljer som er rapportert. Representative resultater omfatter (1) måling av den oppta fra et cytostatisk medikament (doksorubicin) og dens delvise omdannelse til et nedbrytningsprodukt, (2) redoks målinger ved bruk av en genetisk kodet glutation sensor ved tilsetning av et oksidasjonsmiddel, og (3) initiering og merking av cellenekrose ved hemming av mitokondrie respiratoriske kjeden. Forskjellene og fordelene ved den foreliggende SPIM modul i sammenligning med eksisterende systemer er diskutert.
Introduction
I tillegg til godt etablerte metoder (confocal eller multi-foton laserskanning mikros 1-4, strukturert belysning mikros 5,6) lys ark eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) har vist seg å være en verdifull metode for 3D avbildning 7,8, 9. Av spesiell interesse er sin søknad til tre-dimensjonale cellekulturer, f.eks flercellede svulst sfæroider (MCTS), som brukes i økende grad for drug discovery forskning 10,11. Videre er en foretrukket metode SPIM når selv ved langtidseksponering eller gjentatte målinger med lite lys doser er nødvendig for å opprettholde prøven levedyktighet, siden for måling av hvert plan av prøven bare denne flaten er utsatt for lys. Dette er i motsetning til andre mikroskopiteknikker, hvor for deteksjon av hver fokalplanet hele prøven blir belyst, slik at ved registrering av flere fly lysdosen oppsummerer og kan ødelegge prøven 12. </p>
Lett ark mikroskopi eller SPIM er basert på belysning av prøven i perpendikulær retning til observasjons banen enten ved bruk av en sylindrisk linse eller ved å skanne spennende laserstråle (for en gjennomgang se Ref. 8). Dette krever ofte spesielle prøve kamre 13,14 eller matriser, for eksempel, agarose 7,15, implementert i spesielle høykostland mikroskoper. Som et alternativ til disse systemene en forholdsvis enkel belysningsanordning for SPIM har blitt utviklet og tilpasset en konvensjonell invertert mikroskop 16 (se figur 1). Den består av en laserstråle utvidet til en diameter på 8 mm, og fokuseres ved hjelp av en sylindrisk linse (brennvidde 50 mm, numerisk apertur: 0,08) til en lys ark av 6-10 mikrometer tykkelse over en dybdeskarphet på ca 100 um . Prøver ble plassert i en rektangulær kapillar på 600-900 mikrometer indre diameter plassert i front av mikroskopobjektivlinsens for fluorescensdeteksjon. Disse hovedtrekk er for tiden gjennomført og optimalisert ved bruk av avanserte mikrokapillære tilnærminger for holding og for roterende prøvene, synkron innstilling av opplysnings-lyset arket (i aksial retning) og objektivlinse benyttes for fluorescensdeteksjon (identiske optiske bane lengder av fortrengning krever en korreksjon av den mekaniske mate), og tilpasning av en mikrofluidsystem for anvendelse av fluorescerende fargestoffer, farmasøytiske midler eller legemidler, og dermed minimere de nødvendige mengder og utgifter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende manuskriptet beskriver en lys ark eller enkelt plan belysning mikroskopi (SPIM) enhet som er optimalisert for 3-dimensjonale cellesystemer, f.eks flercellede tumor sfæroider (MCTS). Tre eksempelvise applikasjoner inkluderer (1) opptak av et cytostatisk medikament og dets delvise omdannelse til et nedbrytningsprodukt (hvis bidrag til kjemoterapeutisk effekt fremdeles gjenstår å bli evaluert), (2) måling av redoks-tilstand ved bruk av en genetisk kodet glutation sensor ved tilsetning av et oks…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble finansiert av delstaten Baden-Württemberg, samt av EU, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Forfatterne takker Rainer Wittig (ILM Ulm) for å gi U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellelinje og Claudia Hintze for dyktig teknisk assistanse.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
