Summary

Módulo de iluminación solo plano y Aproximación Micro-capilar para un microscopio de campo amplio

Published: August 15, 2014
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Summary

Un módulo para la iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos celulares 3-dimensionales. La muestra se encuentra dentro de un capilar rectangular, y a través de un sistema de microfluidos colorantes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos puede ser aplicado en pequeñas cantidades.

Abstract

Un módulo para la hoja de luz o iluminación microscopía de plano único (SPIM) se describe que se adapta fácilmente a un microscopio de campo amplio invertida y optimizado para cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Las formas del módulo de excitación SPIM y desvía la luz de tal manera que la muestra es iluminada por una lámina de luz perpendicular a la trayectoria de detección del microscopio. El sistema se caracteriza por el uso de un capilar rectangular para sostener (y en una versión avanzada también por un enfoque de micro capilar para hacer girar) las muestras, mediante el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación y la lente del objetivo utilizada para la detección de fluorescencia, así como por la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos en pequeñas cantidades. Se da un protocolo para trabajar con este sistema, y ​​algunos detalles técnicos son reportados. Los resultados representativos incluyen (1) mediciones de la UPtomar de un fármaco citostático (doxorrubicina) y su conversión parcial a un producto de degradación, (2) mediciones redox mediante el uso de un sensor de glutatión codificado genéticamente después de la adición de un agente oxidante, y (3) la iniciación y el etiquetado de necrosis celular de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial. Se discuten las diferencias y ventajas de la presente módulo SPIM en comparación con los sistemas existentes.

Introduction

Además de los métodos bien establecidos (confocal o de múltiples fotones microscopía de escaneo láser 1-4, iluminación estructurada de microscopía 5,6) de lámina de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) ha demostrado ser un valioso método de formación de imágenes 3D 7,8, 9. De particular interés es su aplicación a cultivos de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT), que se utilizan cada vez más para la investigación de descubrimiento de fármacos 10,11. Además, SPIM es un método preferencial cuando incluso después de la exposición a largo plazo o mediciones repetitivas se requieren dosis bajas de luz para mantener la viabilidad de la muestra, ya que para la medición de cada plano de la muestra sólo este plano se expone a la luz. Esto está en contraste con otras técnicas de microscopía, donde para la detección de cada plano focal se ilumina toda la muestra, de modo que tras la grabación de numerosos planos las sumas dosis de luz y puede dañar la muestra 12. </p>

Microscopía de lámina de luz o SPIM se basa en la iluminación de la muestra en dirección perpendicular a la trayectoria de observación ya sea mediante el uso de una lente cilíndrica o escaneando el haz de láser excitante (para una revisión ver ref. 8). Esto a menudo requiere cámaras de muestras especiales 13,14 o matrices, por ejemplo, agarosa 7,15, implementado en los microscopios especiales de alto costo. Como una alternativa a los sistemas de un dispositivo de iluminación sencilla comparable para SPIM se ha desarrollado y adaptado a un microscopio invertido convencional 16 (véase la Figura 1). Se compone de un haz de láser expandido a un diámetro de 8 mm y enfocada por una lente cilíndrica (longitud focal: 50 mm, apertura numérica: 0,08) a una hoja de luz de 6-10 micras de espesor sobre una profundidad de campo de aproximadamente 100 micras . Las muestras se encuentran en un capilar rectangular de 600-900 m de diámetro interior colocado delante del microscopio len objetivos para la detección de fluorescencia. Estas características principales están actualmente completado y optimizado por el uso de enfoques micro-capilares avanzadas para sujetar y para la rotación de las muestras, el ajuste sincrónico de la hoja de luz de iluminación (en dirección axial) y la lente del objetivo utilizados para la detección de fluorescencia (camino óptico idéntico longitudes de desplazamiento requieren una corrección de la alimentación mecánica), y la adaptación de un sistema de microfluidos para la aplicación de tintes fluorescentes, agentes farmacéuticos o medicamentos, minimizando de este modo las cantidades y los gastos necesarios.

Protocol

1. célula que crece esferoide e Incubación Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico Preparar agarosa al 1,5% en medio de cultivo mediante la adición de 0,45 g de agarosa a 30 ml de medio de cultivo (suficiente para 6 platos). Calentar la mezcla de la etapa 1.1.1 a al menos 80 ° C mientras se agita de vez en cuando. Llenar 50 l de la mezcla calentada desde el paso 1.1.2 en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se deja solidificar d…

Representative Results

Experimento 1: esferoides de células incubadas con un fármaco quimioterapéutico Una tomografía z-stack de un esferoide de células previamente incubadas MCF-7 (8 M doxorrubicina, 6 horas) se representa en la figura 3. Proporciona información detallada acerca de la captación celular y la distribución de doxorrubicina 17 y su producto de degradación 18,19. Dentro de la capa celular externa de la doxorubicina fluorescente de color …

Discussion

El presente manuscrito describe una hoja de luz o microscopía de iluminación plano único (SPIM) del dispositivo que está optimizado para sistemas de células de 3 dimensiones, por ejemplo, esferoides tumorales multicelulares (MCT). Tres aplicaciones ejemplares incluyen (1) la absorción de un fármaco citostático y su conversión parcial a un producto de degradación (cuya contribución a la eficacia de la quimioterapia sigue siendo ser evaluado), (2) mediciones del estado redox mediante el uso de un senso…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto fue financiado por el Estado federado de Baden-Württemberg, así como por la Unión Europea, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Los autores agradecen a Rainer Wittig (ILM Ulm) para proporcionar la línea celular U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 y Claudia Hintze para la asistencia técnica en un crack.

Materials

Name of the Material/Equipment Company  Catalog Number Comments/Description(optional)
microtiter plate Orange Scientific 4430100 for cell spheroid growing
agarose  Carl Roth GmbH 3810.1 for cell spheroid growing
MCF-7 cell line CLS Cell Lines Service GmbH 300273 cell line
U251-MG-L106 cell line cell line
DMEM Biochrom AG (Merck Millipore) FG0435 culture medium
DMEM/Ham's F-12 Biochrom AG (Merck Millipore) FG4815 culture medium
FCS Biochrom AG (Merck Millipore) S0615 cell culture supplement
penicillin/streptomycin Biochrom AG (Merck Millipore) A 2213 antibiotics
hygromycin B PAA Laboratories   P02-015 antibiotic
EBSS Sigma-Aldrich Inc. E3024 cell culture supplement
doxorubicin Sigma-Aldrich Inc. D1515 fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)
green cytotoxicity dye Promega GmbH G8742 CellTox – fluorescent cytotoxicity dye
rotenone Sigma-Aldrich Inc. R8875 cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)
hydrogen peroxide (H2O2) Sigma-Aldrich Inc. 95302 reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)
capillary VitroCom  8260-050 sample preparation
microscope Carl Zeiss Jena Axiovert 200M
AxioCam MRc CCD-camera Carl Zeiss MicroImaging GmbH 426508-9901-000 CCD-camera
AxioVision data aquisition software Carl Zeiss MicroImaging GmbH version 4.8.2.
laser diode Pico Quant GmbH LDH-P-C-470 used with driver PDL800-B
perestaltic pump Ismatec Labortechnik MS-1 Reglo re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 
silicone tubes IDEX Health & Science GmbH TYGON R3607

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Cite This Article
Bruns, T., Schickinger, S., Schneckenburger, H. Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope. J. Vis. Exp. (90), e51993, doi:10.3791/51993 (2014).

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