Enplans Illumination Module och Micro-kapillär Närma sig för ett brett fält mikroskop
Summary
En modul för enda plan belysning mikroskopi (SPIM) beskrivs som lätt anpassas till en inverterad brett fält mikroskop och optimerad för 3-dimensionella cellkulturer. Provet är beläget inom en rektangulär kapillär, och via ett mikrofluidsystem fluorescerande färgämnen kan farmaceutiska medel eller läkemedel tillämpas i små mängder.
Abstract
En modul för lättare plåt eller enda plan belysning mikroskopi (SPIM) beskrivs som lätt anpassas till en inverterad brett fält mikroskop och optimerad för 3-dimensionella cellkulturer, till exempel, flercelliga tumör sfäroider (MCTS). De SPIM excitation modul former och avlänkar ljuset så att provet belyses av en ljus ark vinkelrät mot detekteringsbana av mikroskopet. Systemet kännetecknas av användning av en rektangulär kapillär för att hålla (och i en avancerad version också genom en mikro-kapillär tillvägagångssätt för roterande) proven, genom synkron inställning av det belysande ljuset arket och objektivlinsen som används för fluorescensdetektering samt genom anpassning av ett mikrofluidsystem för applicering av fluorescerande färgämnen, farmaceutiska medel eller läkemedel i små kvantiteter. Ett protokoll för att arbeta med detta system ges, och en del tekniska detaljer redovisas. Representativa resultat inkluderar (1) mätningar av uppta ett cytostatikum (doxorubicin) och dess partiella omvandling till en nedbrytningsprodukt, (2) redox mätning med användning av en genetiskt kodad glutation sensor vid tillsats av ett oxidationsmedel, och (3) initiering och märkning av cellnekros vid hämning av den mitokondriella andningskedjan. Skillnader och fördelar med föreliggande SPIM modul i jämförelse med befintliga system diskuteras.
Introduction
Förutom väl etablerade metoder (konfokala eller flera foton laserskanning mikroskopi 1-4, strukturerad belysning mikroskopi 5,6) ljus ark eller enda plan belysning mikroskopi (SPIM) har visat sig vara en värdefull metod för 3D-avbildning 7,8, 9. Av särskilt intresse är dess tillämpning på 3-dimensionella cellkulturer, t.ex. flercelliga tumör sfäroider (MCTS), som används i allt större utsträckning för läkemedelsforskning 10,11. Dessutom är SPIM förmåns metod när även vid långvarig exponering eller upprepade mätningar svagt ljus doser krävs för att upprätthålla provets lönsamhet, eftersom för mätning av varje plan för provet bara detta plan utsätts för ljus. Detta står i motsats till andra mikroskopitekniker där för detektering av varje fokalplan hela provet upplyst, så att vid inspelning av ett flertal plan Ljusdos fattar och kan skada provet 12. </p>
Ljus ark mikroskopi eller SPIM baseras på belysning av provet i vinkelrät riktning till observationsbana antingen genom användning av en cylindrisk lins eller genom att skanna den spännande laserstrålen (för en översikt se ref. 8). Detta kräver ofta speciella provkammare 13,14 eller matriser, t ex agaros 7,15, genomförs i särskilda högkostnadsländer mikroskop. Som ett alternativ till dessa system en jämförelsevis enkel belysningsanordning för SPIM har utvecklats och anpassats till en konventionell inverterat mikroskop 16 (se figur 1). Den består av en laserstråle expanderas till en diameter på 8 mm och fokuseras av en cylindrisk lins (brännvidd: 50 mm, numerisk bländare: 0,08) till en ljus ark av 6-10 um tjocklek över ett skärpedjup på ca 100 nm . Prover är belägna i en rektangulär kapillär av 600-900 um innerdiameter placeras framför mikroskopobjektivet lens för fluorescensdetektering. Dessa huvuddrag för närvarande avslutad och optimeras genom användning av avancerade mikro-kapillära metoder för att hålla och för att rotera proven, den synkrona justeringen på den lysande ljusbladet (i axiell riktning) och objektiv som används för fluorescensdetektion (identisk optisk väg längder av förskjutning kräver en korrigering av den mekaniska foder), och anpassningen av ett mikroflödessystem för tillämpning av fluorescerande färgämnen, farmaceutiska medel eller läkemedel, vilket minimerar de nödvändiga kvantiteter och kostnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuvarande manuskriptet beskriver en lätt ark eller enda plan belysning mikroskopi (SPIM) enhet som är optimerad för 3-dimensionella cellsystem, t.ex. flercelliga tumör sfäroider (MCTS). Tre exempel på användningsområden är (1) upptagning av ett cytostatikum och dess partiella omvandling till en nedbrytningsprodukt (vars bidrag till kemoterapeutisk effekt återstår att utvärderas), (2) mätningar av redoxtillståndet genom användning av en genetiskt kodad glutation sensor på tillägg av ett oxid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet finansierades av delstaten Baden-Württemberg och av EU, Europäischer Fonds für die Regionale Entwicklung. Författarna tackar Rainer Wittig (ILM Ulm) för att tillhandahålla U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 cellinje och Claudia Hintze för skickliga tekniskt stöd.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description(optional) |
| microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | for cell spheroid growing |
| agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | for cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | cell line |
| U251-MG-L106 cell line | cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | cell culture supplement |
| penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | antibiotics |
| hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | cell culture supplement |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox – fluorescent cytotoxicity dye |
| rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| capillary | VitroCom | 8260-050 | sample preparation |
| microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | used with driver PDL800-B |
| perestaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).
- Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- König, K. Multiphoton microscopy in life sciences. J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).
- Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope. Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in development biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model. J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Schneckenburger, H., et al. Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells. J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).
- Schneckenburger, H., et al. Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy. J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).
- Mertz, J., Kim, J. Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection. J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).
- Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams. Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).
- Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).
- Ma, H. L., et al. Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration. Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).
- Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).
- Hovorka, O., et al. Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).
- Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy. J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).
- Lippert, H., Wald, M., Radt, B. Optical arrangement for the production of a light sheet. U.S. Patent. , (2010).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).
- Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy. European Patent Application. , (2013).
